Стимуляция регенераторных процессов в хронических ранах с помощью богатой тромбоцитами аутоплазмы: клинико-экспериментальное исследование

Резюме

Авторы рассматривают проведенное экспериментальное обоснование клинического использования богатой тромбоцитами аутоплазмы, описывают методику ее получения и применения, а также анализируют собственный клинический опыт на основании проведенного рандомизированного контролируемого исследования: в группе исследования эпителизация ран в срок до 3 мес достигнута у 86,4% пациентов, а в группе сравнения - только у 10,8% больных; стоимость лечения в среднем в группе исследования составила 47,6% от стоимости лечения в группе сравнения.

Ключевые слова:богатая тромбоцитами плазма, хронические раны

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2016. № 1. С. 38-43.

Одним из наиболее перспективных направлений лечения хронических ран различной этиологии является ускорение репаративных процессов и регенерации тканей с помощью цитокинов, в том числе ростовых факторов. Источником факторов роста может служить богатая тромбоцитами плазма (БоТП) [1-3]. Тромбоциты содержат такие факторы роста, как тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor - PDGF), тромбоцитарный фактор ангиогенеза (platelet derived angiogenesis factor - PDAF), трансформирующий фактор роста-β (transforming growth factor-β - TGF-β), инсулиноподобный фактор роста (insulin-like growth factor - IGF), тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (platelet derived endothelial cell growth factor - PD-ECGF), эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor - EGF), фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor - FGF), тромбоспондин и остеонектин [2]. Особое значение в процессах репарации и регенерации тканей имеет PDGF, который стимулирует пролиферативную, секреторную и миграционную активность мезенхимальных клеток и является кофактором других ростовых факторов, в частности фактора ангиогенеза VEGF [4].

Формирующиеся тромбоцитарные агрегаты (сгустки) стабилизируются благодаря фибрину и клейким гликопротеинам. Формирующаяся фибриновая матрица способствует нормальной клеточной инфильтрации моноцитов, фибробластов и других клеток, играющих важную роль в заживлении ран.

На современном этапе использование БоТП для ускорения роста кости и мягких тканей стало настоящим прорывом в стоматологии, травматологии, спортивной медицине, косметологии и хирургии [3, 5-17]. Перспективно также использование БоТП для лечения хронических трофических язв нижних конечностей на фоне хронической артериальной и венозной недостаточности. Оценить возможность применения БоТП для стимуляции регенераторных процессов при лечении больных с хроническими ранами - цель настоящего исследования.

Материал и методы

Концентрацию PDGF-BB определяли в плазме и сыворотке крови пациентов с помощью иммуно-флюоресцентного анализа, одновременно проводили морфофункциональный анализ витально окрашенных тромбоцитов неразделенной крови и БоТП [18]. Исследование влияния PDGF сыворотки на пролиферативную активность клеток проводили на культуре фибробластов человека. Клетки выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота в 6-луночных планшетах фирмы при 37 °С и концентрации CO2 5%. Исходное количество клеток во всех лунках составляло 100-110 тыс. на лунку. Наблюдение проводили в течение 5 сут. В лунки опыта добавляли сыворотку крови доноров с известным содержанием PDGF (от 20 до 300 пг на 1 лунку). Оценивали общее количество клеток в культуре (тыс. на 1 лунку) и индекс пролиферативной активности на 3-и сутки культивирования - ИП3 (отношение количества клеток в лунке на 3-и сутки культивирования к количеству клеток на 1-е сутки культивирования).

Для оценки эффективности применения БоТП был проведен анализ результатов лечения 81 пациента с хроническими ранами различной этиологии: трофические язвы венозной этиологии - 8, смешанной этиологии - 20, на фоне синдрома диабетической стопы - 20, посттравматические и послеоперационные рубцово-трофические язвы - 19 и пролежни - 14. Всем пациентам после бактериологических исследований назначались терапия основного заболевания и местное лечение, направленное на очищение и деконтаминацию раны.

У 44 больных (группа исследования) начиная со II фазы раневого процесса применяли аппликации плоского сгустка БоТП. Поверх плоского сгустка БоТП накладывали атравматичную сетчатую повязку, затем вторичную повязку. Кратность перевязок составляла 1 раз в 7 дней, что позволяло перевести пациента на амбулаторный режим.

У 37 больных (группа сравнения) начиная со II фазы раневого процесса применяли традиционные топические средства: повидон-йод, спрей олазоль, гель актовегин, современные атравматичные сетчатые перевязочные материалы. Результаты оценивали в течение 3 мес.

Получение БоТП включало 3 этапа [6, 19]. 1-й этап - забор крови у пациента в зависимости от планируемого объема БоТП в стерильные одноразовые вакутейнеры с цитратом натрия 3,8%. Количество забираемой крови зависит от размера раны и составляет примерно половину от площади раны (в см2). Например, для раны площадью около 100 см2 для получения сгустка БоТП толщиной около 1-2 мм необходимо 45-50 мл цельной крови. Минимальный объем цельной крови для получения БоТП составляет 5 мл, максимальный - 80 мл однократно. Количество получаемой БоТП в среднем составляет 20-25% от исходного объема в зависимости от индивидуальных реологических свойств крови каждого пациента. 2-й этап - фракционирование крови с помощью центрифугирования в течение 8 мин с ускорением 460 g. После центрифугирования с помощью дозатора объемом 1000 мкл с одноразовыми стерильными наконечниками в асептических условиях отбирали фракцию плазмы, богатой тромбоцитами. 3-й этап - активация тромбоцитов с помощью 10% раствора хлорида кальция из расчета 50-70 мкл на 1 мл плазмы. Для получения геля/сгустка необходимого объема и формы активированную БоТП помещали в сухие стерильные одноразовые пробирки или плоские стерильные стеклянные чашки различных диаметров и инкубировали в термостате при температуре 37 оС в течение 10-20 мин. Полученный плоский сгусток укладывали на раневой дефект под атравматичную сетчатую повязку.

Результаты и обсуждение

Применяемая методика позволяет получить плазму с содержанием тромбоцитов в среднем на 338% больше, чем в цельной крови. Во всех случаях в исходной крови и БоТП одного и того же больного относительное содержание функционально пригодных тромбоцитов (клетки с гранулами, способные к адгезии) было практически одинаковым, т.е. процедура получения БоТП не вызывала значимого снижения качества тромбоцитов. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами в БоТП обследованных пациентов варьировало от 33 до 77% (норма 35-75%), абсолютное содержание - от 100 до 650 тыс./мкл (норма 120-600 тыс./мкл). Под действием 10% раствора хлорида кальция происходит массовая активация функционально пригодных тромбоцитов БоТП, в ходе которой наблюдаются выброс гранул за пределы клеток и формирование многочисленных тромбоцитарных агрегатов. В результате после активации хлоридом кальция относительное содержание тромбоцитов с гранулами в БоТП не превышало 1%, абсолютное содержание составляло 1-5 тыс./мкл. В ходе получения плазмы тромбоциты оседают на дно пробирки без видимых повреждений их исходной структуры, поэтому в плазме PDGF присутствует лишь в следовых количествах, тогда как при получении сыворотки образование тромбофибринового сгустка сопровождается массовым выбросом содержимого гранул тромбоцитов, что находит свое отражение в концентрации PDGF. Так, в плазме крови обследованных пациентов концентрация PDGF варьировала от 0 до 2 пг/мл, тогда как в сыворотке - от 90 до 390 пг/мл. Выявлена четкая корреляционная связь между концентрацией PDGF-BB в сыворотке крови и морфофункциональными параметрами тромбоцитов неразделенной крови и БоТП (рис. 1).

Выявлено, что в присутствии БоТП, активированной 10% хлоридом кальция, наблюдалось заметное усиление пролиферативной активности клеток человека в культуре. В течение 1-5 суток после внесения материала БоТП в культуру скорость пролиферации фибробластов увеличивалась в 1,5-2,5 раза при сохранении жизнеспособности этих клеток (рис. 2). При этом отмечено, что ростостимулирующий эффект зависит от концентрации ростовых факторов. Таким образом, в результате исследования in vitro подтверждена эффективность применяемой методики в стимуляции процессов регенерации.

Оценку клинической эффективности применения БоТП в лечении хронических длительно незаживающих ран различной этиологии проводили в отделении гнойной хирургии ГКБ No 13. Учитывая наличие раневых дефектов преимущественно в мягких тканях, БоТП использовали в виде плоского гелеобразного сгустка.

В группе исследования среднее количество аппликаций БоТП на одного больного составило 6,0±0,6. У 3 больных ввиду большой площади ране- вого дефекта после 3-4 аппликаций проведена аутодермопластика раны; у 35 (79,5%) пациентов достигнута полная эпителизация хронической раны в сроки 46,4±4,3 дня, у 1 больного полная эпителизация достигнута в срок более 90 дней, т.е. в срок до 3 мес закрыто 86,4% ран; у 5 больных методика была неэффективной. В группе сравнения аутодермопластика раневого дефекта проведена также у 3 больных, а эпителизация раны в сроки до 3 мес достигнута только у 4 пациентов (10,8%). Средняя длительность стационарного лечения в группе исследования составила 11,0±2,5 дня, в группе сравнения - 23,1±1,5 дня. Необходимо подчеркнуть, что средняя длительность стационарного лечения у пациентов с высоким содержанием тромбоцитов с гранулами в плазме (300-600 тыс./мкл) в среднем составила 7,5 дня, а у пациентов со средним (150-290 тыс./мкл) и низким (100-130 тыс./мкл) содержанием таких тромбоцитов - в среднем 12,7 дня, т.е. эффективность лечения с помощью аутологичной БоТП зависит от содержания в ней функционально пригодных тромбоцитов. Средняя стоимость лечения 1 пролеченного больного в группах различалась более чем в 2 раза и составила по расценкам 2012 г. 33 498,63 руб. в группе исследования и 70 347,12 в группе сравнения, т.е. стоимость лечения в среднем в группе исследования составила 47,6% от стоимости лечения в группе сравнения.

Клинический пример

На амбулаторном лечении находился больной А., 54 года, с хроническими ранами первых пальцев обеих стоп на фоне среднетяжелого течения сахарного диабета типа 2, синдрома диабетической стопы, нейроишемическая форма, I стадия (по Wagner F.W., 1979). В анамнезе длительное (в течение 8 мес) неэффективное лечение различными методами с использованием современных перевязочных средств, мазевых повязок, растворов антисептиков.

При первичном осмотре местно: на медиальной поверхности первых пальцев обеих стоп отмечаются поверхностные раны размерами справа до 12 мм в диаметре, глубиной до 3 мм, слева - 15×7×2 мм, на дне - вялогранулирующая ткань. Проводили перевязки с использованием БоТП с интервалом 7 сут, салфетки Atraumann Ag, фиксацию повязкой Cosmopor. Длительность наблюдения со- ставила 35 дней. За этот период проведено 4 перевязки с БоТП. Результат - полная эпителизация ран (рис. 3).

Рис. 3. Вид ран у больного А. до применения богатой тромбоцитами плазмы: А - справа, Б - слева; через 21 день: В - справа, Г - слева

Заключение

Выбор метода лечения с использованием БоТП предпочтителен у больных с хроническими длительно незаживающими ранами различной этиологии и локализации, особенно при неэффективности лечения другими методами и в отсутствие показаний и возможности радикальных хирургических методов лечения. Использование БоТП не только сокращает длительность и стоимость лечения, но и уменьшает количество перевязок, сокращает период пребывания больного на стационарном лечении, так как большинство больных может наблюдаться амбулаторно, с интервалами между перевязками в 6-8 дней, а также улучшает качество жизни пациентов. Преимуществами использования БоТП являются отсутствие риска переноса заболеваний при применении аутоплазмы, введение факторов роста и цитокинов непосредственно в область раны, восстановление обменных процессов, неоангиогенез, улучшение метаболизма в клетках, активизация местного иммунитета [20-22].

Литература

1. Marx R.E. Platelet-rich plasma: evidence to support its use // J. Oral Maxillofac. Surg. 2004. Vol. 62 (4). P. 489-496.

2. Чекалина Е.Н. Роль тромбоцитарного концентрата в восстановлении и регенерации тканей // Дентал Юг. 2005. No 3 (32). С. 23-27.

3. Pollard T.D., Earnshaw W.C. Cell Biology. N.Y. : Elsivier Science, 2007. 928 р.

4. Caplan A.I., Correa D.J. PDGF in bone formation and regeneration: new insights into a novel mechanism involving MSCs // J. Orthop. Res. 2011. Vol. 29, N 12. P. 1795-1803.

5. Brown R.L., Ormsby I., Doetschman T.C., Greenhalgh D.G. Wound healing in the transforming growth factor-beta-deficient mouse // Wound Repair Regen. 1995. Vol. 3, N 3. P. 25-36.

6. Anitua E., Andia I., Ardanza B., Nurden P. et al. Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration // Thromb. Haemost. 2004. 91, N 1. P. 4-15.

7. Berghoff W.J., Pietrzak W.S., Rhodes R.D. Platelet-rich plasma application during closure following total knee arthroplasty // Orthopedics. 2006. Vol. 29. P. 590-598.

8. Driver V. A Prospective, Randomized, Controlled Trial of Autologous Platelet-Rich Plasma Gel for the Treatment of Diabetic Foot Ulcers // Wound Manag. 2006. Vol. 52, N 6. P. 68-87.

9. Toit D.F., Kleintjes W.G., Otto M.J., Mazyala E.J. et al. Soft and hard-tissue augmentation with platelet-rich plasma: Tissue culture dynamics, regeneration and molecular biology perspective // Int. J. Shoulder Surg. 2007. Vol. 1, N 2. P. 64-73.

10. Crane D., Peter Everts P.A.M. Platelet Rich Plasma (PRP) Matrix Grafts // Pain Manag. 2008. Vol. 8, N 1. P. 12-26.

11. Foster T.E., Puskas B.L., Mandelbaum B.R., Gerhardt M.B. et al. Platelet-rich plasma from basic science to clinical applications // Am. J. Sports Med. 2009. Vol. 37, N 11. P. 2259-2271.

12. Калмыкова Н.В., Скоробогатая Е.В., Берестовой М.А., Кругляков П.В. и др. Сравнительная характеристика тромбоцитар- ных лизатов от разных доноров // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011. No 2. С. 114-117.

13. Кардашова Д.З. Обогащенная тромбоцитами плазма крови: возможности применения в терапии угревой болезни // Инъекционные методы в косметологии. 2011. No 2. С. 60-63.

14. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. М. : Литтерра, 2011. С. 10-56.

15. Оболенский В.Н., Ермолова Д.А. Применение тромбоцитарных факторов роста и коллагеновых биопрепаратов в лечении больных с хроническими трофическими язвами различной этиологии // Хирургия. 2012. Т. 42, No 5. С. 42-47.

16. Ачкасов Е.Е., Безуглов Э.Н., Ульянов А.А., Куршев В.В. и др. Применение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в клинической практике // Биомедицина. 2013. No 4. С. 46-59.

17. Маланин Д.А., Новочадов В.В., Демкин С.А., Демещенко М.В. и др. Обогащенная тромбоцитами аутологичная плазма в лечении пациентов с гонартрозом III стадии // Травматология и ортопедия России. 2014. Т. 73, No 3. С. 52-59.

18. Макаров М.С., Боровкова Н.В., Высочин И.В., Кобзева Е.Н., Хватов В.Б. Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека и его применение в клинической практике // Мед. алфавит. Вып. Современная лаборатория. 2012. Т. 2, No 3. С. 32-34.

19. Юрченко М.Ю., Шумский А.В. Обзор оборудования и методик для получения аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы крови в стоматологии // Новое в стоматологии. 2003. No 7. С. 46-47.

20. Haynesworth S.E., Gostima O., Goldberg V.M., Caplan A.I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow // Bone. 1992. Vol. 13, N 1. P. 81-88.

21. Greenlagh D.G. The role of growth factors in wound healing // J. Trauma. 1996. Vol. 41, N 1. P. 159-167.

22. Marx R.E., Carlson E.R., Eichstaedt R.M., Schimmele S.R. et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 1998. Vol. 85, N 6. P. 638-646.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Дземешкевич Сергей Леонидович
Доктор медицинских наук, профессор (Москва, Россия)

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»