Изучение возможных биохимических и морфологических маркеров феномена "no-reflow" в эксперименте

Резюме

Цель работы - изучить взаимосвязь карбонильных производных протеинов и повреждение эндотелия сосудов как потенциальных предикторов развития феномена "no-reflow" в условиях экспериментального моделирования реперфузии.

 Методы. Исследование выполнено на лабораторных животных (крысах линии Wistar) в соответствии с этическими нормами, изложенными в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986) и приказе Минздрава России No 267 от 19.06.2003 "Об утверждении правил лабораторной практики". Модель реперфузии создавали путем пережатия брюшного отдела аорты с последующим кондиционированием. Определяли активность лизосомальных цистеиновых протеиназ, уровень окислительно-модифицированных белков в плазме, в гомогенатах стенки сосудов и в интактной стенке, выделенной дистальнее операционного вмешательства. Трансмиссионная электронная микроскопия проведена на просвечивающем электронном микроскопе "Libra 120" с автоматическим сканированием изображений (Carl Zeiss, Германия). Статистический анализ результатов исследования проведен, согласно руководству по медицинской статистике с применением современных методов виртуального математического анализа и использованием программы "Statistica 10.0". Для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали критерий Манна-Уитни (U-тест).

Результаты. В ходе проведенного исследования доказано, что при экспериментальном моделировании реперфузии окислительный стресс развивается с 1-х по 7-е сутки в плазме и с 3-х по 7-е сутки в сосудистой стенке. Окислительный стресс в сосудистой стенке характеризуется истощением резервно-адаптационного потенциала и преобладанием вторичных маркеров на фоне активации катепсинов В и L на 3-и и 5-е сутки, что нашло подтверждение в поражении структур интимы.

Вывод. Достоверное увеличение вторичных метаболитов окислительного стресса в стенке сосуда вызвало повреждение эндотелиальных клеток, что может определять важное структурное звено патогенеза феномена "no-reflow".

Ключевые слова:феномен "no-reflow", реперфузия, окислительный стресс, карбонильные производные протеинов, катепсины, эндотелий

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. № 1. С. 62-69.

DOI: 10.24411/2308-1198-2018-00009

Статья поступила в редакцию: 16.08.2017. Принята в печать: 25.01.2018. 

Несмотря на многолетнюю историю исследовательских работ в области реперфузионного повреждения тканей, на сегодняшний день патофизиология феномена "no-reflow" остается недостаточно изученной. Феномен "no-reflow" не специфичен для артерий нижних конечностей. В большей мере он описан при различных исследованиях головного мозга, почек, кожи, миокарда [1-4]. Очевидно, что он имеет многофакторную природу и не может быть описан с помощью какого- либо одного механизма. Основной причиной феномена "no-reflow" становится повреждение сосудов микроциркуляторного русла, носящее как структурный, так и функциональный характер [4-6].

Нарушения микроциркуляции могут быть обусловлены рядом патологических процессов: реперфузионным поражением клеток эндотелия, приводящим к развитию стойкой эндотелиальной дисфункции, отеком перикапиллярных тканей, микроэмболизацией атероматозными и тромботическими массами, воспалительной реакцией в ответ на ишемию (развитие окислительного стресса, активация свободнорадикального повреждения, запуск каскада провоспалительных медиаторов, локальная гиперкоагуляция), функциональными нарушениями автономной (вегетативной) нервной системы [7-9].

Многогранность патофизиологических процессов определяет важность проведения экспериментальных работ в изучении данного феномена с возможностью сопоставления биохимических и морфологических изменений [10].

Материал и методы

Исследование выполнено на 50 лабораторных животных (крысах линии Wistar массой тела 250-300 г). Животных содержали в стандартных условиях вивария: они получали стандартный рацион питания и воду ad libitum в соответствии с этическими нормами, изложенными в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986) и приказе Минздрава России No 267 от 19.06.2003 "Об утверждении правил лабораторной практики".

Создание модели реперфузии путем пережатия брюшного отдела аорты с последующим кондиционированием

Все операции осуществляли под наркозом с использованием препаратов "Ксило" 1 мг/кг и "Золетил 50" 15 мг/кг. Из эксперимента животных выводили передозировкой золетила (Virbac Sante Animale, Франция), внутримышечно, 50 мг/кг. В качестве контроля изучали артериальную стенку интактного животного.

Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии фрагменты сосудистой стенки, выделенные дистальнее места оперативного вмешательства, фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида (Fluka, Швейцария) с постфиксацией в 1% растворе OsO4 (Fluka, Швейцария). Контрастирование проводили 2,5% спиртовым раствором (70° этиловый спирт) уранила ацетата (Fluka, Швейцария). Подготовленные кусочки заливали в смесь смол Эпона и Аралдита М (Fluka, Швейцария). Полутонкие срезы окрашивали азуром II и эозином. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали солями свинца и уранилацетатом по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975). Препараты изучали на транс- миссионном электронном микроскопе "Libra 120" с автоматическим сканированием изображений (Carl Zeiss, Германия).

Для оценки окислительной модификации белков использовали определение уровня карбонильных производных по R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [11]. Площадь под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков определяли по авторской методике, полученное значение выражали в условных единицах/г белка. Активность лизосомальных протеиназ и уровень окислительно-модифицированных белков определяли в гомогенатах стенки сосудов и интактной стенке, выделенных дистальнее операционного вмешательства в 1-е, 3-и, 5-е, 7-е сутки [12]. Активность катепсинов В, L изучали спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [13]. Удельную активность катепсинов в плазме выражали в нмоль амидометилкумарина/ с × г белка. Резервно-адаптационный потенциал оценивали путем подсчета отношения площади под кривой карбонильных производных белков при спонтанном окислении протеинов к индуцированному по реакции Фентона. Для оценки доли первичных маркеров подсчитывали сумму альдегид-динитрофенилгидразонов, для оценки вторичных - сумму кетон-динитрофенилгидразонов, эти значения соотносили с общим содержанием карбонильных производных белков (Sобщ).

Статистический анализ результатов исследо- вания проводили согласно руководству по медицинской статистике с применением современных методов виртуального математического анализа - с использованием программы "Statistica 10.0". Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W-критерий). Результаты представляли в формате Ме [min; max], где Ме - медиана, min и max - минимальное и максимальное значение. Для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест). Для проверки равенства медиан нескольких выборок использовали критерий Краскела- Уоллиса. Для оценки ранговой корреляции использовали коэффициент Спирмена. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Поскольку окислительный стресс является объединяющим признаком почти всех кардиоваскулярных патологий, а модификация белков - надежный критерий его оценки, в качестве биомаркера, отражающего степень повреждения в условиях моделирования реперфузии целесообразно использовать карбонильные производные протеинов.

Полученные значения площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков свидетельствуют о развитии окислительного стресса при моделировании реперфузии в 3-и, 5-е и 7-е сутки в сосудистой стенке и с 1-х по 7-е сутки в плазме (рис. 1).

Рис. 1. Оценка окислительной модификации белков сосудистой стенки (А) и плазмы (Б) при экспериментальном моделировании реперфузии          * - статистически значимые отличия от контрольной группы. 

  Характерным признаком карбонильных производных окисленных белков является формирование СО-группы (альдегид- и кетогруппы): альдегидные производные окисленных белков принято считать ранними маркерами окислительного повреждения белка, а кетонные - поздними, характеризующими степень окислительной деструкции белковой молекулы.

Для оценки степени повреждения белковых молекул анализировали долю первичных и вторичных маркеров окислительного стресса. Из приведенных результатов следует, что при экспериментальном моделировании реперфузии в сосудистой стенке преобладают вторичные маркеры на 3-и и на 5-е сутки (табл. 1), а это в свою очередь свидетельствует об усугублении окислительного стресса и его переходе в позднюю стадию.

Для оценки устойчивости белков к повреждающему воздействию используется реакция Фентона, широко применяемая как источник гидроксильных радикалов. Анализ спонтанной и металл-зависимой окислительной модификации белков позволяет оценить резервно-адаптационный потенциал, косвенно характеризующий оборот белковых молекул. Полученные результаты демонстрируют, что значение резервно-адаптационного потенциала снижается при экспериментальном моделировании реперфузии на 3-и и 5-е сутки в сосудистой стенке, а в плазме отмечается истощение резервно-адаптационного потенциала на 1-е, 3-и, 5-е сутки (рис. 2).

Рис. 2. Состояние резервно-адаптационного потенциала динитрофенилгидразонов (ДНФГ) сосудистой стенки и плазмы при экспериментальной реперфузии 

При экспериментальном моделировании реперфузии наблюдается увеличение активности катепсинов В и L плазмы с 3-х по 7-е сутки (табл. 2). Активность катепсинов В и L сосудистой стенки при ишемии-реперфузии нарастает в условиях окислительного стресса на 3-и, 5-е и 7-е сутки (см. табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что развитие окислительного стресса при реперфузии, а также активация свободнорадикальных процессов плазмы и сосудистой стенки стимулируются напряжением кислорода, приводя к развитию окислительного стресса на 3-и, 5-е, 7-е сутки в сочетании с накоплением вторичных маркеров окислительного стресса.

Исследование соотношения первичных (АДНФГ) и вторичных (КДНФГ) маркеров окислительного стресса дает возможность оценить стадию и потенциальную обратимость окислительного процесса. Необратимое окисление белков, т.е. преобладание вторичных маркеров, свидетельствует об усугублении окислительного стресса, переходе его в позднюю стадию и приводит к утрате биологических свойств протеинов, а в дальнейшем к их агрегации или деградации, что наблюдается при моделировании реперфузии на 3-е и 5-е сутки в сосудистой стенке.

Возможности антиоксидантной защиты кос- венно можно оценить с помощью резервно-адаптационного потенциала. Нами обнаружено, что при моделировании реперфузии на 3-и и на 5-е сутки значение резервно-адаптационного потенциала белков сосудистой стенки снижается, что может свидетельствовать не только об истощении антиоксидантных систем, но и демонстрировать доступность белков к повреждающему действию.

Истощение резервно-адаптационного потенциала белков плазмы с 1-х по 5-е сутки при моделировании реперфузии демонстрирует накопление модифицированных протеинов, что может приводить к формированию белковых агрегатов и затруднять их деградацию протеолитическими системами. В этих патологических условиях лизосомы играют важную роль в жизнедеятельности клетки, так как они способны индуцировать каспазо- и лизосомнозависимый апоптоз клетки.

Однако на фоне истощения резервно-адаптационного потенциала белков плазмы активация лизосомальных цистеиновых протеиназ В и L дает основание полагать, что модифицированные протеины разрушаются протеолитическими системами с образованием пептидов и аминокислот, которые могут быть направлены на синтез новых необходимых клетке протеинов.

Внутриклеточный уровень окисленных белков отражает баланс между процессами формирования карбонильных белков и степенью их деградации протеолитическими системами. Возможно, в условиях окислительного стресса активность лизосомальных протеиназ возрастает вследствие того, что модифицированные белки более чувствительны к протеолизу. При экспериментальном моделировании реперфузии в условиях развивающего окислительного стресса в сосудистой стенке катепсины участвуют не только в деградации поврежденных белковых молекул, но и, косвенно, в ремоделировании сосудов.

Статистически достоверное преобладание вторичных метаболитов в сосудистой стенке на 3-и и 5-е сутки, свидетельствует об усугублении окислительного стресса и необратимости патологического процесса.

Морфологические изменения эндотелия на 3-е сутки приобретают мозаичный характер. Наряду с патологическими процессами происходят адаптационные изменения структур сосудистой стенки. В частности отмечено умеренное расширение просвета некоторых сосудов, а также изменения органелл эндотелиальных клеток: отек отдельных митохондрий, увеличение площади поверхности ядер за счет образование инвагинаций, умеренное усиление микропиноцитоза (рис. 3). Вместе с компенсаторными изменениями обнаружены патологические нарушения эндотелиоцитов кровеносных сосудов, которые характеризуются отеком эндотелиальных клеток - их набуханием и деструкцией отдельных митохондрий.

Митохондрии вакуолизированы, их матрикс просветлен, кристы дезориентированы. Цистерны цитоплазматической сети и пластинчатого комплекса расширены. Превалируют данные, указывающие на реактивные изменения эндотелиоцитов, которые заключаются в том числе в увеличении ядерной поверхности за счет образования инвагинаций различной глубины и выраженной пиноцитозной активности плазмолеммы эндотелиоцитов.

Параллельно в отдельных участках наблюдаются нарушения межэндотелиальных контактов с расширением и отеком перикапиллярного пространства. При электронно-микроскопическом исследовании ультраструктуры были обнаружены изменения эндотелиальных клеток, базальной мембраны сосудов микроциркуляторного русла, перицитов и периваскулярного пространства.

Выявленное чередование "светлых" и "темных" эндотелиоцитов свидетельствует о том, что клетки находятся либо в различных стадиях повреждения, либо в различных фазах функциональной активности; нельзя исключить, что первые находятся в стадии деструкции, а вторые выполняют основную функцию эндотелиального слоя.

К 5-м и 7-м суткам в исследованном сосуде преобладают процессы ремоделирования кровеносных сосудов: деформирование и сужение просвета микрососудов, разрыхление и нарушение целостности базальной мембраны, изменения перицитов, склонность эритроцитов к адгезии и гемолизу.

Эти изменения свидетельствуют о нарушении синхронности участия всего эндотелия в кровоснабжении тканей, повышении проницаемости сосудов и ведут к замедлению микрогемоциркуляции и агрегации клеток крови.

Через 7 сут были выявлены генерализованные изменения: наблюдалось нарушение ультраструктуры всех слоев сосудистой стенки, эндотелиальные клетки находились в состоянии тяжелой дистрофии, некроза, часть их выступала в просвет сосудов в виде сосочков. Просвет сосуда был несколько сужен вследствие отека эндотелиоцитов.

Претерпевают изменения и митохондрии эндотелиальных клеток. Для них характерны отек, просветление матрикса, частичная или полная деструкция крист, вакуолизация.

Базальная мембрана имеет неравномерную толщину и среднюю электронную плотность. В структуре базальной мембраны выявляли вакуолеподобные образования, не ограниченные мембраной. Кроме того, обнаруживали участки разрушения базальной мембраны (рис. 4).

В области разрушения эндотелиального пласта наблюдался контакт эритроцитов крови с коллагеновыми и эластическими волокнами, в этих участках констатировали пристеночный сладж эритроцитов, их агрегацию. Для этих участков отмечали прилежание эритроцитов непосредственно к лейомиоцитам.

В непосредственной близи к участкам десквамации эндотелия, активировались внутриклеточные процессы в фибробластах. Их ядра приобретали фестончатый вид со множеством глубоких и мелких инвагинаций ядерной мембраны. Ядерный хроматин частично конденсировался и концентрировался вблизи ядерной мембраны. В центральной области матрикса появлялись скопления рибосом. Перинуклеарные пространства расширены не были.

Таким образом, при исследовании ультраструктуры сосудистой стенки в группе ишемия-реперфузия были обнаружены адаптивные и патологические изменения в эндотелиальных клетках. Полученнные данные свидетельствуют о значительном нарушении микрогемодинамики в тканях при реперфузии.

Заключение

В настоящее время одним из наиболее важных подходов к лечению облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей служит стратегия своевременной реваскуляризации. Однако существуют патофизиологические механизмы, способные свести к минимуму эффект реваскуляризации даже при ее успешности. В частности, к таким механизмам относится феномен "no- reflow". Сегодня этой проблеме уделяют мало внимания. В связи с активным внедрением новых высокотехнологичных методов и возможностей количество реваскуляризаций конечностей во многих регионах России увеличивается, а следовательно, увеличиваются частота феномена "no-reflow" и его актуальность для отечественного здравоохранения [14], что обусловливает необходимость понимания его клинического значения, основных механизмов возникновения, методов профилактики и лечения. Кроме того, отсутствие однозначных принципов предотвращения этого состояния свидетельствует о необходимости крупных проспективных рандомизированных исследований, посвященных изучению феномена "no-reflow".

В ходе проведенного исследования было доказано, что при экспериментальном моделировании реперфузии окислительный стресс развивается с 1-х по 7-е сутки в плазме и с 3-х по 7-е сутки в сосудистой стенке. Окислительный стресс в сосудистой стенке характеризуется истощением резервно-адаптационного потенциала и преобладанием вторичных маркеров на фоне активации катепсинов В и L на 3-и и 5-е сутки, что нашло подтверждение в поражении структур интимы и может определять важное структурное звено патогенеза феномена "no-reflow".

Литература

1. Коваль М. Феномен "no-reflow" - ложка дегтя в бочке меда реваскуляризации // Med. Review. 2008. No 5 (05). С. 32-36. 

2. Van de Werf F., Bax J., Betriu A. et al. Management of acute myocardial infarction in patients presenting with persistent ST-segment elevation: The Task Force on the management of ST- segment elevation acute myocardial infarction of the European Society of Cardiology // Eur. Heart J. 2008. Vol. 29. P. 2909- 2945.

3. Ito H. No-reflow phenomenon and prognosis in patients with acute myocardial infarction // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2006. Vol. 3. P. 499-506.

4. Fischell T.A. Pharmaceutical interventions for the management of no-reflow // J. Invasive Cardiol. 2008. Vol. 20, N 7. P. 374- 379.

5. Lee K.W., Norell M.S. Management of "no-reflow" complicating reperfusion therapy // Acute Card. Care. 2008. Vol. 10, N 1. P. 5-14.

6. Valero S.J., Moreno R., Reyes R.M., et al. Pharmacological approach of no-reflow phenomenon related with percutaneous coronary interventions // Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 2008. Vol. 6, N 2. P. 125-129.

7. Лущак В.И. Свободно-радикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма // Биохимия. 2007. Т. 72, вып. 8. С. 995-1017.

8. Vasil’ev Y.V. et al. Protein modifications by electrophilic lipoxidation products: adduct formation, chemical strategies and tandem mass spectrometry for their detection and identification // Mass Spectrom. Rev. 2013. Vol. 33, N 3. P. 157-182.

9. Hristova M., Penev M. Oxidative stress and cardiovascular diseases // Vasc. Pharmacol. 2012. Vol. 12, N 3. P. 296-303.

10. Абаленихина Ю.В., Фомина М.А., Исаков С.А.. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсина L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота // Рос. мед.-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. 2013. No 1. С. 44-48.

11. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и др. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопр. мед. химии. 1995. Т. 41, No 1. С. 24-26.

12. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях. Патент на изобретение РФ No 2524667. Бюл. 27.07.2014.

13. Barrett A.J. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L // Methods Enzymol. 1981. Vol. 80. P. 535-561.

14. Калинин Р.Е., Пшенников А.С., Сучков И.А. Реперфузионное повреждение тканей в хирургии артерий нижних конечностей // Новости хир. 2015. Т. 23, No 3. С. 348-352.