Молекулярно-генетический анализ гена TTN у детей с дилатационной кардиомиопатией

Резюме

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) встречается в популяции с частотой около 1:250. В педиатрической группе это заболевание диагностируется ежегодно с частотой 0,57 на 100 тыс. детей. Медико-генетическое консультирование по поводу этого заболевания включает не только верификацию генетического диагноза, но и определение риска повторного рождения ребенка с ДКМП, а также оценку перспектив пресимптоматической (в том числе пренатальной) диагностики и преимплантационного генетического тестирования. По разным оценкам, от 10 до 30% случаев ДКМП обусловлены мутациями в гене TTN. Проведенные исследования в основном касались взрослой или смешанной возрастной группы пациентов с ДКМП. Частота мутаций в гене TTN, особенности проявлений и их прогностическое значение в детском возрасте изучены не были.

Цель - определить частоту мутаций в гене TTN у детей с ДКМП и актуальность включения этого гена в протокол ДНК-диагностики при педиатрических формах заболевания.

Материал и методы. Полное клиническое и инструментальное обследование 25 пациентов с ДКМП было выполнено в специализированных кардиологических центрах. Молекулярно- генетическое исследование включало секвенирование последовательностей кодирующей и прилегающих регуляторных последовательностей главной сердечной изоформы N2BA гена TTN методом полупроводникового секвенирования на платформе IonTorrentTM (для 20 изолированных случаев) и полноэкзомное секвенирование в формате trio на платформе Illumina (для 5 семейных случаев).

Результаты и обсуждение. В группу были включены 25 пробандов, у которых диагноз ДКМП был установлен в возрасте до 17 лет (средний возраст - 6,5 года). Соотношение полов (М:Ж) составило 17:7. Спорадических случаев ДКМП было 20, семейных случаев - 5 (диагноз ДКМП также был поставлен хотя бы одному из родителей и/или сибсу). Однако ни у одного из пробандов не выявлено ни одной известной или новой мутации, ведущей к возникновению преждевременного стоп-кодона, либо каких-то других потенциально патогенных замен. По-видимому, TTN-зависимые формы ДКМП манифестируют позднее, в молодом (но старше 18 лет) или более зрелом возрасте.

Заключение. Результаты этого исследования не позволяют рассматривать ген TTN как первую линию ДНК-диагностики ДКМП в педиатрической группе, несмотря на публикации о высокой частоте мутаций в этом гене при ДКМП в целом. Необходимы дальнейшие исследования по сравнению представленности мутаций в гене TTN в разных возрастных группах пациентов с ДКМП. 

Ключевые слова:дилатационная кардиомиопатия, TTN, сердечная недостаточность у детей, первичные кардиомиопатии, секвенирование нового поколения

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. № 1. С. 70-76.

DOI: 10.24411/2308-1198-2018-00010

Статья поступила в редакцию: 15.01.2018. Принята в печать: 25.01.2018. 

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) - 3-я по частоте причина сердечной недостаточности и 1-я по частоте причина пере- садки сердца [1]. Масштабных эпидемиологических исследований ДКМП немного; долгое время встречаемость этого заболевания оценивалась в 1:2700-1:2500, базируясь на исследовании 1984 г., проведенном Codd и соавт. [2]. Однако в настоящее время считается, что распространенность ДКМП в этом исследовании могла быть существенно недооценена, и в работе Hershberger и соавт. приводится обоснование цифры почти в 10 раз выше - около 1:250 в популяции [3]. У детей это заболевание диагностируется ежегодно с частотой 0,57 на 100 тыс. детей только в США; выявляемость этого заболевания в других странах сходная [4]. ДКМП может развиваться под влиянием генетических (первичная) или негенетических (вторичная) факторов, частота первичных форм в педиатрической группе больных достигает 70% [1, 4]. ДКМП у детей характеризуются быстрым прогрессированием и высокой летальностью [5]. У педиатрических больных 5-летняя вероятность смерти или трансплантации сердца составляет 46% [4]. Поскольку о причинах, в том числе генетических, ДКМП у детей известно немного, протоколы лечения во многом представляют собой адаптированные протоколы лечения взрослых пациентов, и их эффективность ограничена. Для радикального лечения прогрессирующей сердечной недостаточности у детей, так же как и у взрослых, в настоящее время используются ортотопическая трансплантация сердца (выполняется не во всех странах) и вспомогательные устройства механической поддержки сердца [6].

Поэтому неудивительно, что при медико-генетическом консультировании по поводу этого тяжелого и неуклонно прогрессирующего заболевания для родителей важен вопрос не только верификации генетического диагноза, но и знание риска повторного рождения ребенка с этим заболеванием, а также перспектив пресимптоматической (в том числе пренатальной) диагностики и преимплантационного генетического тестирования. Однако вспомогательные репродуктивные технологии могут быть предложены семье только в том случае, если идентифицирована патогенная мутация.

Среди всех первичных кардиомиопатий подходы к ДНК-диагностике для ДКМП разработаны в наименьшей степени. В согласованных экспертных Рекомендациях по генетической диагностике кардиомиопатий и каналопатий 2011 г. было указано, что ни один из известных генов не является причиной >5% случаев первичной ДКМП, нет протокола приоритетной ДНК-диагностики [7]. В первую очередь такая ситуация связана с исключительным генетическим разнообразием ДКМП. По меньшей мере для 70 генов была показана роль в развитии ДКМП - гены белков ядерной мембраны (LMNA, EMD), саркомерных белков (MYH7, TPM1), белков цитоскелета (FKRP), регуляторов содержания кальция и ионных каналов (PLN, SCN5A), факторов транскрипции (EYA4) и т.д. [8]. Небольшая, но стабильно выявляемая доля мутаций была показана только для мутаций в генах SCN5A и LMNA для особого клинического варианта ДКМП, сопровождающейся нарушением атриовентрикулярного (АВ) проведения (по 5-10%) [7]. Однако такое большое разнообразие генов и отсутствие частых мутаций стали причинами того, что генетическая структура этого заболевания была мало изучена, и доли мутаций в каждом гене не были определены. Только с развитием методов секвенирования нового поколения (new generation sequencing, NGS) стали проводиться по-настоящему масштабные генетические исследования этого заболевания. В результате этих исследований впервые был определен ген, мутации в котором встречались у значимой доли пробандов с ДКМП - ген TTN, кодирующий саркомерный белок титин. До внедрения методов NGS ген TTN изучался слабо в связи со своими гигантскими размерами [9].

Но благодаря ряду исследований было показано, что мутации в этом гене являются лидирующей по частоте причиной ДКМП [8-13]. По разным оценкам, от 10 до 30% случаев ДКМП обусловлены мутациями в гене TTN [11]. Значимое количество больных с идентифицированными мутациями позволило провести первые оценки прогностического значения выявления мутаций в этом гене. Было показано, что выживаемость и отдаленный прогноз больных с ДКМП могут зависеть от генетической формы заболевания [14]. Однако известно также, что мутации в гене TTN обладают неполной пенетрантностью, при этом у больных пациентов мутация в титине часто отягощена патогенными вариантами в других связанных с ДКМП генах [15].

Проведенные исследования в основном касались взрослой или смешанной возрастной группы пациентов с ДКМП [16, 17]. Частота мутаций в гене TTN, особенности проявлений и их прогностическое значение в детском возрасте не изучены.

Цель настоящей работы - определить частоту мутаций в гене TTN у детей с ДКМП и актуальность включения этого гена в протокол ДНК-диагностики при педиатрических формах ДКМП.

Материал и методы

Полное клиническое и инструментальное обследование пациентов было выполнено в специализированных кардиологических и кардиохирургических центрах и отделениях, где были диагностированы и/или наблюдались дети с ДКМП.

Медико-генетическое консультирование и молекулярно-генетическое исследование было выполнено в соответствии с принципами Хельсинской декларации, информированное согласие на ДНК- диагностику было дано родителями или опекунами несовершеннолетних пациентов.

Молекулярно-генетическое исследование было выполнено на ДНК, выделенной из образцов венозной крови или из парафиновых блоков (в 2 случаях ДНК-диагностика была выполнена postmortem) стандартными наборами реагентов. Для 20 пробандов (спорадические случаи, единственный больной в семье) было выполнено секвенирование последовательностей кодирующей и прилегающих регуляторных последовательностей главной сердечной изоформы N2BA гена TTN методом полупроводникового секвенирования на платформе IonTorrentTM. Для 5 пробандов (семейные случаи) и их родителей было выполнено полноэкзомное секвенирование в формате trio на платформе Illumina. Для фрагментов гена TTN с недостаточным покрытием, а также для подтверждения выявленных генетических вариантов было выполнено контрольное капиллярное секвенирование по Сенгеру.

Все генетические варианты, аннотированные программой IonReporter, были проанализированы при помощи открытых биоинформатических ресурсов. Генетические варианты с частотой >1% не рассматривались как потенциально патогенные. Для проверки влияния на сплайсинг использовали ресурсы HumanSplicingFinder и NetGene2 [18, 19].

Результаты и обсуждение

В обследуемую группу были включены 25 пробандов, у которых диагноз ДКМП был впервые установлен на основании общепринятых критериев в возрасте от 5 дней до 17 лет (в одном случае диагноз ДКМП с синдромом некомпактного миокарда был установлен пренатально на сроке 30 нед внутриутробного развития); средний возраст составил 6,5 года. Соотношение полов (М:Ж) составило 17:7. Спорадических случаев ДКМП было 20, семейных случаев - 5 (диагноз ДКМП был также поставлен хотя бы одному из родителей и/или сибсу).

У всех пробандов был проведен поиск мутаций в гене TTN, кодирующем саркомерный белок титин. Все выявленные генетические варианты в гене TTN, идентифицированные у пробандов, были описанными частыми вариантами, не имеющими явного клинического значения. Учитывая опубликованные сообщения о значительной (до 30%) частоте патогенных генетических вариантов в гене TTN [1, 9], ведущих к появлению укороченной изоформы белка, мы ожидали выявления не менее 6-8 мутаций в обследованной группе. Однако ни у одного пробанда не выявлено ни одной известной или новой мутации, ведущей к возникновению преждевременного стоп-кодона, либо каких-то других потенциально патогенных замен.

На этом фоне особо примечателен тот факт, что в одной семье с повторными случаями рождения детей с ДКМП была выявлена делеция c.21019A в 72-м экзоне гена TTN, приводящая к сдвигу рамки считывания (рис. 1). Обычно делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, по умолчанию считаются патогенными, и описанию именно такого класса мутаций в гене TTN в качестве самой частой генетической причины ДКМП посвящено много работ [8-13].

Семья обратилась за медико-генетическим консультированием в том числе для планирования и проведения пренатальной и/или преимплатационного генетического тестирования (ПГТ) в связи с двумя случаями неуклонно прогрессирующей ДКМП у детей, приведшей к смерти от сердечной недостаточности в возрасте до 5 лет (родословная семьи DCM119 представлена на рис. 1). Однако выявление этой делеции в определенной степени можно считать случайной находкой, так как она была выявлена в рамках секвенирования экзома trio у клинически здоровой матери пробанда и отсутствовала в ДНК пробанда, умершего от ДКМП.

Клиническая интерпретация генетических вариантов, встречающихся в гене TTN, очень сложна. Это связано как с огромными размерами белка и объективной трудностью выполнения функционального анализа мутаций, так и с высокой частотой встречаемости стоп-кодонов и мутаций сплайсинга в здоровой популяции, которая доходит до 2-3% [3, 9]. Было показано, что клинический эффект мутаций, даже приводящих к возникновению преждевременных стоп-кодонов и изменению сайтов сплайсинга, сильно зависит от того, какой домен белка они затрагивают.

Краткий обзор патогенных вариантов, встречающихся в гене TTN

Белок титин представлен высокоповторяющимися последовательностями, около 90% его массы занимают иммуноглобулиновые (Ig) и фибронектиновые (FN-III) домены, разделенные неповторяющимися последовательностями с сайтами фосфорилирования, PEKV-мотивами, и киназа в терминальном отделе (рис. 2) [10, 19]. Два противоположно ориентированных титиновых филамента заключены между Z-дисками саркомера и участвуют в поддержании структуры саркомера и его стабилизации [12]. Эластический I-диск выполняет функцию пружины, восстанавливая исходную длину саркомера после систолы и ограничивая растяжимость во время диастолы [3]. Нерастяжимый А-диск связывает миозин и миозин-связывающий белок, участвует в детекции и передаче биомеханических сигналов, а С-концевой М-диск содержит киназу, участвующую в ответах на сигналы растяжения, и влияет на экспрессию генов и ремоделирование при ДКМП [8].

Рис. 2. Структура гена TTN и кодируемого им белка (схема основана на искусственной изоформе IC, включающей большинство экзонов): А - структура молекулы титина. Показаны основные группы доменов и некоторые экзоны; Б - схема гена TTN с указанием варианта со сдвигом рамки считывания, обнаруженный у здорового человека (*). Цветовая схема гена соответствует схеме белка части "А". Показано расположение основных структурных элементов относительно Z-, I- и A-дисков саркомера. FNIII - фибронектиновый домен тип III, Ig10 - иммуноглобулиновый домен 10, PEVK - область с высоким содержанием пролина, глутаминовой кислоты, валина и лизина, N2A и N2B - области, специфичные для определенных изоформ титина (10, 20, 25) 

Миссенс-мутации, вызывающие несинонимичные замены, такие как p.Val54Met, p.Arg743Val, p.Trp930Arg в N-концевой области молекулы титина (Z-пластинка саркомера), снижают сродство к титину белков Z-пластинки и также могут приводить к развитию ДКМП [13, 20-22]. 

Однако вследствие трудностей выполнения функционального анализа новых миссенс-мутаций, в настоящее время основное внимание уделяется генетическим вариантам с более однозначным влиянием на белок - мутациям сплайсинга и нонсенс-мутациям.

Проведенные биоинформатические исследования показали, что патогенность варианта в гене TTN зависит от того, насколько широко экзон с мутацией представлен во всех изоформах белка и какой домен он затрагивает [23]. Патогенные мутации группируются по сегментам гена, соответствующим определенным структурам в молекуле белка в составе саркомера [20].

Значительная часть стоп-кодонов, приводящих к ДКМП, возникают в экзонах, представленных в сердечных изоформах, и транслируемых в C-концевой области белка, входящей в зону А-диска и M-диска саркомера [20]. Некоторые клинически значимые и приводящие к преждевременным стоп-кодонам варианты обнаружены также в областях гена, соответствующих Z-пластинке и I-диску (p.Ser493*/c.1478C>A, p.Lys14528*/ c.43582A>T соответственно) [12].

В случае семьи DCM119, выявленная делеция со сдвигом рамки считывания (отмечена звездочкой на рис. 2) локализована в области I-диска, где выявляются как популяционные (нейтральные), так и патогенные варианты. Поэтому клиническая интерпретация этой находки довольно трудна. Во-первых, молодой возраст носительницы генетического изменения (40 лет) не позволяет однозначно утверждать, что у нее нет риска развития ДКМП на 5-6 десятилетии жизни. С другой стороны, этот вариант однозначно не является ни основной, ни второстепенной причиной развития ранней формы ДКМП у детей, и на основании этой находки семье не может быть предложена ни пренатальная диагностика, ни преимплантационное генетическое тестирование.

Эта находка еще раз подчеркивает важность крайне осторожной интерпретации результатов ДНК-диагностики, выполненной на образцах ДНК родителей, а не пробанда, когда от умершего ребенка не осталось или почти не осталось биологического материала. Даже убедительно выглядящие находки у родителей при малейшей возможности должны подтверждаться на образцах пробанда, несмотря на трудности работы с давно хранившимся или минимальным материалом умершего больного.

В целом, результаты этого исследования оказались несколько неожиданными: ни одной мутации в гене TTN у больных ДКМП, диагностированных в возрасте до 17 лет, не выявлено. Эти данные можно лишь отчасти объяснить ограниченным размером выборки или этническими особенностями российской группы больных.

Нам представляется, что структура генетических причин ДКМП в разном возрасте различается. По-видимому, TTN-зависимые формы ДКМП манифестируют позднее, в молодом (но старше 18 лет) или в более зрелом возрасте. Данные о корреляции генотип-фенотип при ДКМП недостаточны. Исследования среднесрочной выживаемости больных с ДКМП показали, что мутации в гене TTN не ассо- циированы с ухудшением прогноза по сравнению с другими больными ДКМП [23].Получены данные, что пациенты c TTN-обусловленной ДКМП имеют лучший прогноз по сравнению с LMNA-зависимой кардиомиопатией по скорости прогрессирования сердечной недостаточности, но имеют высокий риск жизнеугрожающих желудочковых нарушений ритма сердца [14, 24]. Однако во всех случаях речь шла об обследованных группах больных со средним возрастом клинической манифестации ДКМП в 40-50 лет [14, 23, 26], что по сравнению с педиатрической группой пациентов, безусловно, явля- ется лучшим прогнозом.

Заключение

Отсутствие патогенных замен у пациентов с манифестацией ДКМП в возрасте до 17 лет указывает на возможность существования различных генетических причин ДКМП в разных возрастных группах. Кроме того, это позволяет предположить более благоприятное течение TTN-опосредованных форм ДКМП по сравнению с детскими формами заболевания. Результаты этого исследования не позволяют рассматривать ген TTN как первую линию ДНК-диагностики ДКМП в педиатрической группе, несмотря на публикации о высокой частоте мутаций в этом гене при ДКМП в целом. Необходимы дальнейшие исследования по срав- нению представленности мутаций в гене TTN в разных возрастных группах пациентов с ДКМП.

Данная работа была выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда 16-15-10421. 

Литература

1. Maron B.J., Towbin J.A., Thiene G., Antzelevitch C., et al.; American Heart Association; Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; Council on Epidemiology and Prevention. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups; and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation. 2006; 113 (14): 1807-16.

2. Roberts A.M., Ware J.S., Herman D.S., Schafer S., et al. Integrated allelic, transcriptional, and phenomic dissection of the cardiac effects of titin truncations in health and disease. Sci Transl Med. 2015; 7 (270): 270ra6. doi: 10.1126/scitranslmed.3010134.

3. Akinrinade O., Koskenvuo J.W., Alastalo T.-P. Prevalence of titin truncating variants in general population. PLoS One. 2015; 10 (12): e0145284. doi: 10.1371/journal.pone.0145284.

4. Rusconi P., Wilkinson J.D., Sleeper L.A., Lu M., et al.; for the Pediatric Cardiomyopathy Registry Investigators. Differences in Presentation and Outcomes between Children with Familial Dilated Cardiomyopathy and Children with Idiopathic Dilated Cardiomyopathy: A Report from the Pediatric Cardiomyopathy Registry Study Group. Circ Heart Fail. 2017; 10: e002637. doi: 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.115.002637.

5. Bollen I.A.E., van der Meulen M., de Goede K., Kuster D.W.D., et al. Cardiomyocyte hypocontractility and reduced myofibril density in end-stage pediatric cardiomyopathy. Front Physiol. 2017; 8: 1103. doi: 10.3389/fphys.2017.01103. eCollection 2017.

6. Everitt M.D., Sleeper L.A., Lu M., Canter C.E., et al.; Pediatric Cardiomyopathy Registry Investigators. Recovery of echocar- diographic function in children with idiopathic dilated cardiomyopathy: results from the pediatric cardiomyopathy registry. J Am Coll Cardiol. 2014; 63 (14): 1405-13.

7. Ackerman M.J., Priori S.G., Willems S., Berul C., et al.; Heart Rhythm Society (HRS); European Heart Rhythm Association (EHRA).HRS/EHRA expert consensus statement on the state of genetic testing for the channelopathies and cardiomyopathies: this document was developed as a partnership between the Heart Rhythm Society (HRS) and the European Heart Rhythm Association (EHRA). Europace. 2011; 13 (8): 1077-109.

8. Dellefave L., McNally E.M. The genetics of dilated cardiomyopathy. Curr Opin Cardiol. 2010; 25 (3): 198-204.

9. Herman D.S., Lam L., Taylor M.R., Wang L., et al. Truncations of titin causing dilated cardiomyopathy. N Engl J Med. 2012; 366 (7): 619-28. PubMed Central PMCID: PMC3660031.

10. Gigli M., Begay R.L., Morea G., Graw S.L., et al. A Review of the Giant Protein Titin in Clinical Molecular Diagnostics of Cardiomyopathies. Front Cardiovasc Med. 2016; 3: 21.

11. Verdonschot J.A.J., Hazebroek M.R., Derks K.W.J., Barandiar n Aizpurua A., et al. Titin cardiomyopathy leads to altered mitochondrial energetics, increased fibrosis and long-term life-threatening arrhythmias. Eur Heart J. 2018 Jan 25.

12. Franaszczyk M., Chmielewski P., Truszkowska G., Stawinski P., et al. Titin truncating variants in dilated cardiomyopathy - prevalence and genotype-phenotype correlations. PLoS One. 2017; 12 (1): e0169007.

13. Itoh-Satoh M., Hayashi T., Nishi H., Koga Y., et al. Titin mutations as the molecular basis for dilated cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 291: 385-93.

14. Tobita T., Nomura S., Fujita T., Morita H., et al. Genetic basis of cardiomyopathy and the genotypes involved in prognosis and left ventricular reverse remodeling. Sci Rep. 2018; 8 (1): 1998. doi: 10.1038/s41598-018-20114-9.

15. Haas J., Frese K.S., Peil B., Kloos W., et al. Atlas of the clinical genetics of human dilated cardiomyopathy. Eur Heart J. 2015; 36 (18): 1123-35.

16. Tayal U., Newsome S., Buchan R., et al. Phenotype and clinical outcomes of titin cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2017; 70 (18): 2264-74. doi:10.1016/j.jacc.2017.08.063.

17. Akinrinade O., Alastalo T.P., Koskenvuo J.W. Relevance of truncating titin mutations in dilated cardiomyopathy. Clin Genet. 2016; 90 (1): 49-54. doi: 10.1111/cge.12741.

18. URL: http://www.umd.be/HSF3/

19. URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/

20. Roberts A.M., Ware J.S., Herman D.S., Schafer S., et al. Integrated allelic, transcriptional, and phenomic dissection of the cardiac effects of titin truncations in health and disease. Sci Transl Med. 2015; 7 (270): 270ra6. PubMed Central PMID: PMC4560092.Gerull B., Atherton J., Geupel A., Sasse-Klaassen S., et al. Identification of a novel frameshift mutation in the giant muscle filament titin in a large Australian family with dilated cardiomyopathy. J Mol Med. 2006; 84: 478-83.

21. Matsumoto Y., Hayashi T., Inagaki N., Takahashi M., et al. Functional analysis of titin/connectin N2-B mutations found in cardiomyopathy. J Muscle Res Cell Motil. 2005; 26: 367-74.

22. Tayal U., Newsome S., Buchan R., Whiffin N., et al. Phenotype and clinical outcomes of titin cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2017; 70 (18): 2264-74. doi: 10.1016/j.jacc.2017.08.063.

23. Tayal U., Newsome S., Buchan R., Whiffin N., et al. Truncating variants in titin independently predict early arrhythmias in patients with dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol Lett. 2017; 69 (19): 2466-8.

24. Taylor M., Graw S., Sinagra G., Barnes C., et al. Genetic variation in titin in arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy - overlap syndromes. Circulation. 2011; 124 (8): 876-85. PMID: 21810661.