Протезирующая герниопластика с использованием бактериальной наноцеллюлозы: экспериментальное исследование

Резюме

Цель - оценить возможность использования бактериальной целлюлозы в качестве материала для протезирующей герниопластики грыж передней брюшной стенки.

Материал и методы. В экспериментальных исследованиях на собаках изучена возможность протезирования дефекта передней брюшной стенки с использованием новых материалов. В качестве протезирующего материала были использованы пластины влажной (99,9%) бактериальной наноцеллюлозы (БНЦ), полученной путем биосинтеза с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12. Биосинтез БНЦ осуществлен на питательной среде, в основе своей состоящей из ферментативного гидролизата технической целлюлозы из плодовых оболочек овса. Все технологические стадии получения БНЦ из плодовых оболочек овса проведены согласно авторскому запатентованному способу. Полученная бактериальная целлюлоза представляет собой химически чистую целлюлозу, имеет степень кристалличности 88% и на 99% состоит из триклинной фазы Iα. Грыжу передней брюшной стенки моделировали путем выполнения среднесрединной лапаротомии. В дальнейшем к несомкнутым краям апоневроза фиксировали пластину бактериальной целлюлозы. Наряду с этим проведено сравнительное исследование укрепления дефекта апоневроза как пластиной БНЦ, так и отрезком полипропиленовой сетки "Ульрапро" (Этикон). На 14-е и 60-е сутки проводили забор материала с визуальной оценкой его расположения в тканях передней брюшной стенки и последующим гистоло- гическим исследованием. Дополнительно проведена микроскопия полученных образцов БНЦ.

Результаты. Установлена хорошая фиксация материала БНЦ в тканях передней брюшной стенки с формированием на 14-е сутки вокруг нее капсулы из мягких тканей, показана последующая деградация БНЦ на 60-е сутки послеоперационного периода с развитием в области размещения материала активных репаративных процессов и замещением его устойчивыми новообразованными соединительнотканными элементами (фибробласты, фибрин), менее выраженными по сравнению с фиксацией полипропиленовой сетки, не обнаружено гнойных осложнений на протяжении всего послеоперационного периода.

Заключение. Полученные результаты показывают возможность применения БЦН для протезирующей герниопластики.

Ключевые слова:грыжа передней брюшной стенки, протезирующая герниопластика, бактериальная наноцеллюлоза

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. Т. 6, № 2. С. 59-66.
doi: 10.24411/2308-1198-2018-12008.

Статья поступила в редакцию: 04.04.2018. Принята в печать: 20.04.2018.

В настоящее время основной способ хирургического лечения паховых грыж и послеоперационных вентральных грыж передней брюшной стенки включает протезирующую герниопластику с использованием синтетических сеток, являющихся матриксом для образования соединительной ткани с формированием комплекса, состоящего из нерассасывающихся или рассасывающихся нитей сетки как основы с интегрированной в нее богатой коллагеном рубцовой ткани [1, 2]. Несмотря на широкий ассортимент материалов эндопротезов для герниопластики, наиболее используемым остается полипропилен [3, 4]. Однако, говоря о его положительных свойствах, необходимо отметить и ряд недостатков: хронический болевой синдром при избыточном образовании фиброзной ткани на фоне воспаления, которое сетка вызывает в окружающих тканях; ограничение подвижности передней брюшной стенки вследствие плотного фиброза; ощущение инородного тела в зоне имплантации; адгезия с подлежащими петлями тонкого и толстого кишечника при отсутствии отграничения (брюшина, сальник) при ненатяжной герниопластике (in lay, sub lay); спаечная кишечная непроходимость; высокая стоимость композитных рассасывающихся синтетических протезов с противоадгезивным покрытием (Рrосееd и Sofradim). В этой связи важное значение придается поиску и использованию новых материалов в герниологии, и одним из них может стать бактериальная целлюлоза [5].

Бактериальная наноцеллюлоза (БНЦ) - органический материал, синтезируемый внеклеточно микроорганизмами. Молекулярная формула и наноструктура БНЦ соответствуют целлюлозе, выделенной из растительного сырья, но при этом БНЦ за счет трехмерной структуры, образованной микрофибриллами, обладает более высокой кристалличностью, модулем прочности на разрыв, водопоглащающей способностью, пластичностью [6]. Она широко используется в текстильной, бумажной и пищевой промышленности [7-9].

Некоторые свойства БНЦ - пористость, влажность, нетоксичность, биосовместимость, высокая прочность - позволяют применять этот материал в биомедицине, включая инженерию костной ткани [10], формирование кровеносных сосудов в микрохирургии [11-13], сердечно-сосудистой хирургии (при дефектах сонных артерий) [14], разработку сосудистых стентов [15], лечение ожогов [16] и восстановление кожи [17], замену хрящевой ткани уха [18], регенерацию нервов [19], лечение трофических язв [20], в том числе при синдроме диабетической стопы [21], замену твердой мозговой оболочки [22], лечение заболеваний парадонта [23], восстановления костей носа [24], в качестве матрицы для роста роговицы [25]. Переплетение волокон БНЦ образует пористую структуру, что позволяет ей сорбировать практически любые лекарственные препараты, различные вещества технического назначения, включать в свой состав природные и синтетические полимеры, минеральные вещества, кластеры металлов, т.е. бактериальная целлюлоза (БЦ) является перспективной матрицей для получения композиций с заранее заданными свойствами. В последние годы на основе наноцеллюлозного материала разрабатываются некоторые биосистемы для различных фармацевтических приложений с контролируемым высвобождением веществ, импрегнированных в его состав: тетрациклина [26], лидокаина [27], аминокислот с сывороточным альбумином [28], серебра [29].

Таким образом, БНЦ с ее стабильностью, относительно низкой скоростью деградации, биосовместимостью, возможностью сорбции и адсорб- ции представляется перспективным материалом: она может способствовать повышению эффективности лечения больных с грыжами передней брюшной стенки, особенно при послеоперационных вентральных грыжах путем применения ненатяжной протезирующей герниопластики с защитой дефекта от сращений с органами брюшной полости.

Цель исследования - в эксперименте изучить возможности применения БНЦ в качестве материала для протезирующей герниопластики дефектов передней брюшной стенки.

Материал и методы

В качестве материала для экспериментальных исследований были использованы пластины БНЦ, полученной путем биосинтеза с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12. Биосинтез БНЦ осуществлен на питательной среде, в основе своей состоящей из ферментативного гидролизата технической целлюлозы из плодовых оболочек овса. Все технологические стадии получения БНЦ из плодовых оболочек овса проведены согласно авторскому запатентованному способу [30]. Полученная БЦпредставляет собой химически чистую целлюлозу, имеет степень кристалличности 88% и на 99% состоит из триклинной фазы Iα [31].

Экспериментальное исследование было выполнено на 5 собаках, содержащихся в стандартных условиях вивария. Под общей анестезий с соблюдением международных норм гуманного обращения с животными и уходу за ними (Европейская конвенция "О защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях", Страсбург, 1986 г.), а также с одобрения этического комитета ФГБОУ ВО "Алтайский государственный медицинский университет" Минздрава России в стерильных условиях операционного блока кафедры общей хирургии, оперативной хирургии и топографической анатомии на собаках выполнялась ненатяжная герниопластика с использованием различных протезирующих материалов. В начале исследования были изучены изменения в тканях передней брюшной стенки при имплантации в нее пластины БЦ сроком на 2 нед. Для этого во время первой операции после выполнения под средне-срединной лапаротомии длиной до 7 см к краям апоневроза непрерывным атравматическим швом фиксировался отрезок БНЦ размером 6,0×1,5 см.

Визуальную оценку фиксации и забор материала для гистологического исследования с целью изучения реакции мягких тканей выполняли в процессе релапаротомии в ближайшем послеопераци- онном периоде, в основном на 14-е сутки.

Второй этап нашего экспериментального исследования был сравнительный. Моделировали грыжевой дефект передней брюшной стенки путем послойного рассечения тканей передней брюшной стенки с выполнением срединной лапаротомии до 10 см в длину. В углах образованной раны формировали 2 участка: верхний и нижний. Далее выполняли ненатяжную герниопластику с использованием в качестве протезирующих устройств различных материалов. В верхнем участке срединной раны к несомкнутым краям апоневроза непрерывным швом фиксировали отрезок из БНЦ размером 4,0×1,5 см.

Для сравнения в нижнем участке этой срединной раны по периметру к несомкнутым краям апоневроза передней брюшной стенки непрерывным швом фиксировали аналогичный отрезок полипропиленовой сетки "Ультрапро" (производитель Ethicon, Бельгия, США).

После окончательной фиксации БНЦ и полипропиленовой сетки послойно накладывали швы на подкожно-жировую клетчатку и кожу. Сравнительную визуальную и гистологическую оценку результатов фиксации БНЦ и полипропиленовой сетки к апоневрозу передней брюшной стенки проводили через 60 сут после операции. Для морфологического исследования иссекали небольшие лоскуты тканей передней брюшной стенки с обоими эндопротезами. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, а также окраской на фибрин по Пикро-Маллори.

Результаты и обсуждение

При обьективном исследовании оказалось, что через 14 сут после фиксации БНЦ в тканях передней брюшной стенки используемая пластина была окутана мягкими тканями, которые погрузили ее в капсулу без прорастания основного слоя. БНЦ изменила цвет с матово-белого на желтый, структура ее стала более плотной. Жидкостных скоплений, признаков нагноения не было. Между пластиной БНЦ и подлежащими тканями имелись рыхлые сращения, которые легко удалялись при мобилизации материала, под ним была заметна незрелая грануляционная ткань белесоватого цвета.

При микроскопическом исследовании гистологических образцов на 14-е сутки было установлено, что на границе БНЦ и тканей передней брюшной стенки идет нарастание мигрирующих в эту область клеточных элементов, представленных нейтрофилами, лимфоцитами (умеренная лейкоцитарная инфильтрация), которые располагались большими скоплениями (рис. 1). Кроме того, у края БНЦ имело место накопление форменных элементов крови с образованием неокапилляров (рис. 2) с эритроцитами на границе.

При исследовании материала с использова- нием окраски на фибрин (по Пикро-Маллори) на границе БНЦ и тканей передней брюшной стенки наблюдалось формирование молодого (рис. 3) и зрелого фибрина, который образовывался в форме глыбок, что указывало на происходящие в этой области репаративные процессы.

При посеве ткани передней брюшной стенки на среды бактериального роста не выявлено. Через 60 сут после имплантации БНЦ и полипропиленовой сетки при визуальной оценке реакции мягких тканей передней брюшной стенки мы также не отметили признаков инфицирования или формирования жидкостных скоплений. Материал был укрыт и хорошо фиксирован к краям апоневроза (рис. 4). Стоит отметить, что полноценный рубец в это время окончательно не был сформирован в обоих случаях.

При рассечении верхнего участка раны мы не обнаружили четко выраженного материала БНЦ. Вместо него имелась умеренно выраженная соединительная ткань. Наоборот, в области фиксации полипропиленовой стеки в нижнем углу раны наблюдались более грубые рубцовые структуры, к которым со стороны брюшной полости фиксировались сальник и петля тонкой кишки, что не отмечалось в отрезке с БНЦ, где были лишь небольшие сращения с сальником. При гистологическом исследовании препаратов через 60 сут после имплантации БНЦ в поле зрения почти не видна (рис. 5).

В тканях передней брюшной стенки наблюдалась выраженная функциональная активность макрофагов, заключающаяся в увеличении их количества в препарате по сравнению с тканями, содержащими полипропиленовую сетку. Диаметр ядер макрофагов на препарате с БНЦ был увеличен почти в 2 раза по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, а также возросло количество вакуолей и фагоцитированных частиц в их цитоплазме. Все это указывало на поглощение (биодеградацию) БНЦ. Параллельно отмечалось появление фибробластов на фоне снижения интенсивности лейкоцитарной инфильтрации с формированием в этой области ровных фибриновых слоев (рис. 6).

При анализе гистологической картины препаратов ткани передней брюшной стенки с полипропиленовой сеткой было отмечено, что волокна последней (рис. 7) были погружены в полости элипсовидной формы с умеренной лейкоцитарной инфильтрацией и плотными слоями фибрина вокруг (рис. 8).

Таким образом, нами изучены краткосрочные результаты экспериментального применения БНЦ в качестве протезирующего материала при грыжах передней брюшной стенки. В дальнейшем формирование карскаса передней брюшной стенки из соединительной ткани на основе матрицы из БНЦ планируется отследить в течение 1 года.

Выводы

1. В экспериментальных исследованиях после имплантации пластин БНЦ в ткани передней брюшной стенки на 14-е и на 60-е сутки послеоперационного периода инфицирования материала не выявлено.

2. Через 14 сут после имплантации БНЦ вокруг нее образуется рыхлая мягкотканная капсула с элементами асептического воспаления с формированием молодого фибрина на границе с материалом.

3. При сравнительном анализе фиксации в тканях передней брюшной стенки БНЦ и полипропиленовой сетки "Ультрапро" на 60-е сутки отмечены признаки биодеградации БНЦ, доказываемые функциональной активностью макрофагов и замещением материала новообразованной соединительной тканью, плотность структурных элементов (фибробласты, фибрин) которой была несколько менее выражена по сравнению с регенератом, сформированным на основе полипропиленовой сетки.

Работа по биосинтезу бактериальной наноцеллюлозы выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект No 17-19-01054).

Литература

1. Егиев В.Н., Воскресенский П.К., Емельянов С.И. Ненатяжная герниопластика. М. : Медпрактика-М, 2002. 147 с.

2. Седов М.В., Тарбаев С.Д., Гостевский А.А. Эффективность герниопластики с использованием полипропиленового сетчатого имплантата в лечении послеоперационных вентральных грыж // Вестн. хир. 2005. No 3. С. 85-87.

3. Coda A., Lamberti R., Martorana S. Classification of prosthetics used in hernia repair based on weight and biomaterial // Hernia. 2012. Vol. 16. P. 9-20. doi: 10.1007/s10029-011-0868-z.

4. Todros S., Pavan P.G., Pachera P., Natali A.N. Synthetic surgical meshes used in abdominal wall surgery: Part I - materials and structural conformation // J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. 2017. Vol. 105, N 4. P. 892-903. doi: 10.1002/jbm.b.33586.

5. Falcao S.C., Coelho A.R., Evencio Neto J. Biomechanical evaluation of microbial cellulose (Zoogloea sp.) and expanded polytetrafluoroethylene membranes as implants in repair of produced abdominal wall defects in rats // Acta Cir. Bras. 2008. Vol. 23, N 3. P. 184-191. URL: http://dx.doi.org/10.1590/S0102-86502008000200012.

6. Dahman Y. Nanostructured biomaterials and biocomposites from bacterial cellulose nanofibers // J. Nanosci. Nanotechnol. 2009. Vol. 9, N 9. P. 5105-5122. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19928189.

7. Громовых Т.И., Фан Ми Хань, Бирюков Е. Г., Данильчук Т.Н., Абдрашитова Г.Г. Перспективы применения бактериальной целлюлозы в мясопродуктах // Мясная индустрия. 2013. No 4. C. 32-35.

8. Hioki N., Hori Y., Watanabe K., Morinaga Y. et al. Bacterial cellulose as a new material for papermaking // Jpn. TAPPI J. 1995. Vol. 49. P. 718-723.

9. Iguchi M., Yamanaka S., Budhiono A. Bacterial cellulose - a masterpiece of nature’s arts // J. Mater. Sci. 2000. Vol. 35. P. 261- 270. URL: https://doi.org/10.1023/A:1004775229149.

10. Saska S., Barud H.S., Gaspar A.M.M., Marchetto R. et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite nanocomposites for bone regeneration // Int. J. Biomater. 2011. Vol. 2011. Article ID 175362. P. 1-8. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2011/175362.

11. Klemm D., Schumann D., Udhard U., Marsch S. Bacterial synthesized cellulose: artificial blood vessels for microsurgery // Prog. Polym. Sci. 2001. Vol. 26, N 9. P. 1561-1603. doi: 10.1016/S0079- 6700(01)00021-1.

12. Brown E.E., Laborie M.-P.G., Zhang J. Glutaraldehyde treatment of bacterial cellulose/fibrin composites: impact on morphology, tensile and viscoelastic properties // Cellulose. 2012. Vol. 19. P. 127-137. URL: https://doi.org/10.1007/s10570-011-9617-9.

13. Wippermann J., Schumann D., Klemm D., Kosmehl H. et al. Preliminary results of small arterial substitute performed with a new cylindrical biomaterial composed of bacterial cellulose // Eur. J. Vasc. Endovasc. 2009. Vol. 37, N 5. P. 592-596. URL: https://doi.org/10.1016/j.ejvs.2009.01.007.

14. Schumann D., Wippermann J., Klemm D. et al. Artificial vascular implants from bacterial cellulose: preliminary results of small arterial substitutes // Cellulose. 2009. Vol. 16. P. 877-885. URL: https://doi.org/10.1007/s10570-008-9264-y.

15. Fink H., Faxalv L., Molnar G.F., Drotz K. et al. Real-time measurements of coagulation on bacterial cellulose and conventional vascular graft materials // Acta Biomater. 2010. Vol. 6. P. 1125- 1130. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19800035.

16. Czaja W., Krystynowicz A., Kawecki M., Wysota K. et al. Biomedical applications of microbial cellulose in burn wound recovery // Cellulose: Molecular and Structural Biology. Dordrecht : Springer, 2007. P. 307-321. URL: https://doi.org/10.1007/978-1- 4020-5380-1_17.

17. Fu L. ,Zhang J., Yang G. Presentstatus and applications of bacterial cellulose-based materials for skin tissue repair // Carbohydr. Polym. 2013. Vol. 92. P. 1432-1442. doi: 10.1016/j.carbpol.2012.10.071. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23399174.

18. Nimeskern L., Avila HM., Sundberg J. et al. Mechanical evaluation of bacterial nanocellulose as an implant material for ear cartilage replacement // J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2013. Vol. 22. P. 12-21. URL: https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2013.03.005.

19. Kowalska-Ludwicka K., Cala J., Grobelski B., Sygut D. et al. Modified bacterial cellulose tubes for regeneration of damaged peripheral nerves // Arch. Med. Sci. 2013. Vol. 9. P. 527-534. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3701969.

20. Portal O., Clark W.A., Levinson D.J. Microbial cellulose wound dressing in the treatment of nonhealing lower extremity ulcers // Wounds. 2009. Vol. 21, N 1. P. 1-3. URL: https://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/25904579.

21. Solway D.R., Clark W.A., Levinson D.J. A parallel open-label trial to evaluate microbial cellulose wound dressing in the treatment of diabetic foot ulcers // Int. Wound J. 2011. Vol. 8, N 1. P. 69-73. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21159127.

22. Rosen C.L., Steinberg G.K., DeMonte F., Delashaw J.B. Jr et al. Results of the prospective, randomized, multicenter clinical trial evaluating a biosynthesized cellulose graft for repair of dural defects // Neurosurgery. 2011. Vol. 69, N 5. P. 1093-1103. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21670715.

23. Melo da Fonte J.B., Valido D.P., Filho L.X. et al. Otoliths/ bacterial cellulose nanocomposite as a potential dental pulp capping biomaterial in canine model // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. 2015. Vol. 120. P. 105. URL: http://dx.doi.org/10.1016/j.oooo.2015.02.469.

24. Amorim W.L., Costa H.O., de Souza F.C. et al. Estudo experimental da resposta tecidual a presenca de celulose produzida por Acetobacter xylinum no dorso nasal de coelhos // Braz. J. Otorhino- laryngol. 2009. Vol. 75. P. 200-207. URL: http://www.redalyc.org/ html/3924/392437883008.

25. Hui Jia, Yuanyuan Jia, Jiao Wang, Yuan Hu et al. Poten- tiality of bacterial cellulose as the scaffold of tissue engineering of cornea // Proceedings of the 2nd International Conference on Biomedical Engineering and Informatics (BMEI 2009). Tianjin, China, 2009. doi: 10.1109/BMEI.2009.5305657.

26. Stoica-Guzun A., Stroescu M., Tache F., Zaharescu T. et al. Effect of electron beam irradiation on bacterial cellulose membranes used as transdermal drug delivery systems // Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. B. 2007. Vol. 265. P. 434-438. URL: http://dx.doi.org/10.1016/j.nimb.2007.09.036.

27. Trovatti E., Silva N.H., Duarte I.F., Rosado C.F. et al. Biocellulose membranes as supports for dermal release of lidocaine //Biomacromol. 2011. Vol. 12. P. 4162-4168. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21999108.

28. Muller A., Ni Z., Hessler N., Wesarg F. et al. The biopolymer bacterial nanocellulose as drug delivery system: investigation of drug loading and release using the model protein albumin // J. Pharm. Sci. 2013. Vol. 102, N 2. P. 579-592. URL: https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23192666.

29. Maria L.C.S., Santos A.L.C., Oliveira P.C., Valle A.S.S. et al. Preparation and antibacterial activity of silver nanoparticles impregnated in bacterial cellulose // Polimeros Ciencia Tecnologia. 2010. Vol. 20, N 1. P. 72-77. URL: http://dx.doi.org/10.1590/S0104- 14282010005000001.

30. Пат. РФ No 2597291, МПК С12N 1/22, C12P 19/04. Спо- соб получения бактериальной целлюлозы / Будаева В.В., Гладышева Е.К., Скиба Е.А., Сакович Г.В. No 2015129304/10 ; заявл. 16.07.2015 ; опубл. 10.09.2016, Бюл. No 25. 9 с.

31. Сакович Г.В., Скиба Е.А., Будаева В.В., Гладышева Е.К. и др. Технологические основы получения бактериальной наноцеллюлозы из сырья с нулевой себестоимостью // Докл. АН. 2017. Т. 477, No 1. С. 109-112.