Тестирование аддитивных материалов на культурах клеток фибробластов человека

Резюме

Актуальность. Для полного восстановления функциональности кисти после хирургических вмешательств или травм требуется максимально точно повторить анатомию ее утраченных сегментов. Эта амбициозная задача возможна при использовании 3D-моделирования и аддитивных технологий.

Цель исследования - тестирование аддитивных материалов, полученных из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного спекания, на культурах клеток фибробластов человека. В рамках поставленной цели решались следующие задачи: определение цитотоксичности представленных материалов, определение влияния исследуемых материалов на пролиферативную активность дермальных фибробластов в культуре, определение адгезии дермальных фибробластов к исследуемым материалам. Проведенное исследование является проспективным, II уровня доказательности.

Материал и методы. Для исследования были представлены образцы аддитивного материала, полученного из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного сплавления. Тестирование проводилось на культуре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа, согласно межгосударственному стандарту, методом прямого контакта (ГОСТ ISO 10993-5-2011).

Результаты. Тестирование образцов аддитивного материала на адгезивность продемонстрировало, что число клеток, обнаруживаемых прикрепленными к поверхности исследуемого материала, составляет >97% (по сравнению с группой контроля - 81,5%). Отмечено отсутствие цитотоксичности исследуемых материалов в результате лактатдегидрогеназного теста. Грубых изменений морфофункциональных характеристик дермальных фибробластов в присутствии образцов аддитивного титана не выявлено. Также отмечена хорошая пролиферативная активность клеток в присутствии тестируемых материалов. При этом нежизнеспособные клетки со- ставляли <5% на всех сроках эксперимента.

Заключение. Таким образом, тестирование представленных образцов на культуре дермальных фибробластов человека методом прямого контакта по рекомендациям межгосударственного стандарта ГОСТ ISO 10993-5-2011 показало отсутствие цитотоксичности, высокий пролиферативный потенциал и сохранение жизнеспособности клеток. Данные результаты входят в рамки доклинического испытания аддитивного материала для изготовления персонифицированных эндопротезов суставов кисти.

Ключевые слова:кисть, суставы кисти, персонифицированные эндопротезы, аддитивные технологии, фибробласты человека

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. Т. 6, № 2. С. 67-73.

doi: 10.24411/2308-1198-2018-12009.
Статья поступила в редакцию: 01.06.2017. Принята в печать: 20.04.2018.

Кисть человека, или дистальная часть верхней конечности, обладает особым значением [1-4]. С помощью рук и мелкой моторики, движений всех пальцев, люди познают мир и взаимодействуют с ним [5-8]. Кисть и пальцы - главные инструменты в любой работе. Снижение их функциональности во многом приводит к уменьшению трудоспособности, ограничению возможностей человека [9-10]. На современном этапе развития техники и технологий функция кисти должна быть восстановлена максимально, так как для управления сложными механизмами требуются точные, строго дозированные движения [11-12].

Цель исследования - тестирование аддитивных материалов, полученных из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного спекания, на культурах клеток фибробластов человека.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

  • определение цитотоксичности представленных материалов;
  • определение влияния исследуемых материалов на пролиферативную активность дермальных фибробластов в культуре;
  • определение адгезии дермальных фибробластов к исследуемым материалам.

Проведенное исследование является проспективным, II уровня доказательности.

Материал и методы

Тестируемые материалы. Для исследования были представлены:

- образцы аддитивного материала, полученного из титанового порошка марки ВТ1-00 методом лазерного сплавления, в виде квадратных пластин размером 0,5×0,5 см (24 образца) и дисков площадью 3,8 см(12 образцов); толщина образцов - 0,2 см;

- сырье для получения этого материала - мелкодисперсный титановый порошок марки ВТ1-00.

Образцы каждого вида были герметично упакованы в отдельные двойные пластиковые пакеты и стерилизованы оксидом азота (рис. 1).

Рис. 1. Общий вид фрагментов эндопротезов для исследований

Ход и методы эксперимента

Работа проведена в лаборатории культур клеток ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России. Данная лаборатория оснащена комплексом чистых помещений класса Б в соответствии со стандартом ISO5. Все работы с материалом выполняли в ламинарных боксах БАВп-01 "Ламинар-С" (ЗАО "Ламинарные системы", Миасс, Россия) II класса биологической защиты с применением всех правил асептики и антисептики. В исследовании использовали одноразовую пластиковую посуду квалификации "для культур клеток": культуральные флаконы 25 и 75 см2, чашки Петри диаметром 3,5 см, 24-луночные планшеты с плоским дном (все - Orange Scientific, Бельгия), 12-луночные планшеты со вставками (NUNK, США). Все использованные реактивы производства ООО "Биолот" (Россия).

Тест-система. Тестирование проведено на куль- туре дермальных фибробластов человека 7-го пассажа, согласно межгосударственному стандарту методом, прямого контакта (ГОСТ ISO 10993-5-2011). Забор первичного материала (биоптаты кожи) проводили, основываясь на положениях Федерального закона РФ "О трансплантации органов и (или) тканей человека" от 22.12.1992 No 4180-1 и после одобрения Комитетом по биоэтике при ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России. Донор был соматически здоров.

Фибробласты выращивали по методике первичных эксплантатов с использованием полной ростовой среды [среда 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 40 мкг/мл гентамицина] в СО2-инкубаторе (Sanyo - Incubator, MCO-17A, Япония) при температуре 37 °С, постоянной влажности и 5% СО2. Перед исследованием выращенную культуру идентифицировали с помощью морфологических и биохимических методов. Установлено, что клетки являются детерминированными и принадлежат к фибробластическому дифферону; кариотипирование показало, что клетки являются диплоидными и имеют 46 хромосом. Обследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показало отсутствие контаминации культуры инфекционными агентами, в том числе микоплазмами и цитомегаловирусами.

Для решения поставленных задач проведено 3 серии экспериментов.

Серия 1. Определение цитотоксичности представленных материалов при помощи лактатдегидрогеназного (ЛДГ) теста.

Дермальные фибробласты высевали на дно лунок 24- и 12-луночных планшетов дозе 1×10клеток/см и культивировали при 37 °С и постоянной влажности в условиях СО2-инкубатора (Sanyo - Incubator, MCO-18A, Япония) с использованием полной ростовой среды (среда 199 с добавлением 10% ЭТС) до образования равномерного конфлюэнтного монослоя.

Образцы аддитивного материала в виде квадратных пластин размером 0,5×0,5 см помещали на монослой в лунки 24-луночных планшетов. Порошок титана вносили на сетки планшетных вставок 12-луночных планшетов в дозе 0,2140 г. Расстояние нижнего края сетки до дна планшетов составляло 5 мм, что исключало механическое повреждающее действие порошка на клетки. Ростовую среду заменяли на свежую и продолжали культивирование в течение 48 ч.

Контролями служили полная ростовая питательная среда, образец экспериментального материала, погруженный в полную ростовую питательную среду, культура клеток в полной ростовой питательной среде. Всего в каждой позиции задействовано по 6 лунок.

Сущность ЛДГ-теста заключается в том, что, поскольку ЛДГ является цитоплазматическим ферментом, она появляется в культуральной жидкости только при нарушении целостности клеточных мем- бран, и соотношение ее активности в культуральной среде и в клетках на носителе (культуральном пластике исследуемом материале) отражает соотношение живых и поврежденных клеток в данной культуре [1].

Активность ЛДГ определяется следующим образом. Культуральную среду отбирали в эппендорфы и центрифугировали. Носитель дважды ополаскивали фосфатно-солевым буфером, помещали в эппендорфы, добавляли 0,001 моль фосфатного буфера (рН=7,4). Сохранившиеся на носителе живые клетки разрушали путем двукратного замораживания-оттаивания. Отбирали по 1 мл культуральной среды и лизата клеток, добавляли к каждой аликвоте 1 ммоль пирувата и 0,2 ммоль восстановленного никотинамидадениндинуклео- тида (NADH), затем облучали на спектрофотометре (СФ-56, "ЛОМО", Санкт-Петербург) при длине волны 340 нм. Активность ЛДГ определяли по убыли NADH в ходе реакции превращения пирувата в лактат:

Piruvate+NADH ↔ Lactate+NAD.

Количество поврежденных клеток (DC) определяли как отношение активности ЛДГ в среде (LDHm) к суммарной активности ЛДГ в лизате (LDHl) и в ростовой среде и выражали в процентах:

DC (%)=(LDHm/LDHl + LDHm)×100.

Достоверность полученных данных оценивалась по U-критерию Манна-Уитни.

Серия 2. Определение влияния исследуемых материалов на пролиферативную активность и жизне- способность дермальных фибробластов в культуре.

Посев и культивирование фибробластов осу- ществляли аналогично 1-й серии с той разницей, что материал вносили в планшеты через 24 ч после посева клеток, после того как клетки равномерно адгезировались к культуральному пластику и образовали контакты между собой. Контроль - культура фибробластов, в лунки с которой исследуемые материалы не вносили. Общая длительность эксперимента составляла 7 сут.

Ежедневно проводили визуальную оценку и фотографирование культуры с помощью инвертированного микроскопа "Olympus СКX41" (Olympus Corporation, Япония) при увеличении 100, 200 и 400. Оценивали структурные особенности клеток и монослоя в целом, с помощью окулярной сетки Автандилова считали количество клеток в монослое, затем вычисляли плотность монослоя на единицу площади (мм2).

Через 24 ч (1 сут), 3, 5 и 7 сут от момента помещения материала на монослой часть чашек изымали из эксперимента. Препараты окрашивали гематокси- лином Майера и суданом IV для выявления структурных изменений, а также трипановым синим для верификации жизнеспособных и поврежденных клеток в монослое. Препараты изучали и фотографировали с помощью автоматизированной аналитической системы, включающей микроскоп "Olympus ВX41", цифровую фотокамеру ProgR CF, системный блок на базе процессора Intel Pentium 4. Была использована программа "Видеотест Морфология 5.2". В препаратах, окрашенных гематоксилином Майера и суданом IV, подсчитывали количество клеток на единицу площади; в препаратах, окрашенных трипановым синим, - процентное соотношение жизнеспособных и поврежденных (живых и мертвых) клеток.

На основании полученных данных рассчитывали индекс пролиферации, время удвоения и количество удвоений культуры.

Индекс пролиферации (IP) определяли по формуле (1):

IP=N2/N1, (1)

где N1 - количество клеток монослоя, принятое как исходное; N2 - количество клеток монослоя через 24 ч культивирования.

Индекс пролиферации высчитывали через каждые 24 ч культивирования. За первое значение N1 принимали плотность монослоя через 24 ч после посадки клеток.

Время удвоения культуры (TD) рассчитывали по формуле (2):

TD = t×lg2/lg(Nt/N0), (2)

где t - время роста культуры (ч); N0 - начальное количество клеток; Nt - количество клеток через t ч.

Количество удвоений культуры (К) вычисляли по формуле (3):

К=(lgNt-lgN0)/lg2, (3)

где N0 - количество клеток в монослое через 24 ч после посадки; Nt - количество клеток в монослое по окончании эксперимента.

Серия 3. Определение адгезии дермальных фибробластов к исследуемым материалам.

На дно лунок 24-луночных планшетов помещали образцы аддитивного материала в форме дисков (по 1 в каждую лунку - всего 12 образцов). Сверху на 6 дисков и в 6 свободных лунок планшета высевали дермальные фибробласты в дозе 1×10клеток/см2, 6 образцов оставляли в качестве контрольных. Во все лунки вносили полную ростовую среду до объема 2,5 мл. Культивирование проводили в тех же условиях, что и в сериях 1 и 2, в течение 48 ч.

Статистическая обработка результатов культуральных и морфологических исследований проведена с использованием t-критерия Стьюдента, биохимических - с использованием U-критерия Манна-Уитни для малых выборок. Результаты были представлены в виде среднего арифметического (M) и стандартной ошибки выборочной средней (m). Значимыми считались отличия при p<0,05(95%).

Результаты

Тестирование образцов аддитивного материала на адгезивность продемонстрировало, что число клеток, обнаруживаемых прикрепленными к по- верхности материала, полученного методом лазерного сплавления из порошка титана марки ВТ1-00, составляет 81,5% от числа клеток, находящихся на поверхности пластика (контроль) к моменту проведения ЛДГ-теста. В то же время индекс адгезии дермальных фибробластов к поверхности непори- стого титана данной марки составляет >97%.

При тестировании на цитотоксичность как образцов аддитивного материала (табл. 1), так и порошка титана марки ВТ1-00 (табл. 2) было выяв- лено, что различия показателей ЛДГ-теста между опытными и контрольными группами не достоверны - это говорит об отсутствии цитотоксичности исследуемых материалов.

Изучение морфофункциональных характеристик дермальных фибробластов, культивированных в присутствии образцов, показало, что на протяжении всего эксперимента ни в одной серии грубых изменений не происходило, клетки сохраняли присущий фибробластам человека характер роста (монослойный, в виде завитков), целостность монослоя, преимущественно веретеновидную форму, 2-4 отростка (рис. 2). Они содержали 1 овальное ядро, четко отграниченное от мелкозернистой цитоплазмы ядерной оболочкой. Плотность монослоя в непосредственной близости от образцов не отличалась от таковой в отдаленных зонах. Характерно, что все культуры за время эксперимента проходили одинаковое количество удвоений (от 4,18 до 4,25) и достигали плотности насыщения через 7 сут после посева (табл. 3-5), что говорит о хорошей пролиферативной активности клеток в присутствии тестируемых материалов. Темпы пролиферации клеток в сериях также не отличались от контроля. Культура дермальных фибробластов как в контроле, так и в присутствии образцов исследуемых материалов активно пролиферировала первые 4 сут после посева, затем темп этого процесса замедлялся, о чем свидетельствуют прогрессивное снижение индекса пролиферации (IP) и увеличение времени удвоения культуры (TD) (табл. 3). Плотность насыщения, т.е. формирование полного равномерного плотного монослоя, резкое замедление пролифе- рации и переход культур в стационарное состояние были достигнуты одновременно - через 8 сут после посева клеток и через 7 сут после помещения образцов на монослой.

Рис. 2. Культивирование дермальных фибробла- стов в присутствии адди- тивного материала. 3-и сутки эксперимента

Анализ окрашенных препаратов также не выявил существенных отличий между опытными и контрольными культурами. При окраске толуидиновым синим нежизнеспособные клетки (рис. 3) составляли <5% на всех сроках эксперимента.

Заключение

Таким образом, тестирование представленных образцов на культуре дермальных фибробластов человека методом прямого контакта по рекомендациям межгосударственного стандарта ГОСТ ISO 10993-5-2011 показало отсутствие цитотоксичности, высокий пролиферативный потенциал и сохранение жизнеспособности клеток. Данные результаты входят в рамки доклинического испытания аддитивного материала для изготовления персонифицированных эндопротезов суставов кисти.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Lopez E., Figueroa S., Oset-Gasque M J., Gonzalez M.P. Apoptosis and necrosis: two distinct events induced by cadmium incortical neurons in culture // Br. J. Pharmacol. 2003. Vol. 138. P. 901-911.

2. Булычева И.В., Соловьев Ю.Н. Морфология протезированных суставов. Семинары по костной патологии // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2012. No 3. С. 57-64.

3. Гатитулин М.Н., Башарин И.А. Ротационное измельчение порошков для аддитивных технологий и порошковой металлургии // Вестн. соврем. науки. 2015. No 1. С . 26-33.

4. Куньпэн Х., Беспальчук П.И. Эндопротезирование проксимального межфалангового сустава пальца кисти при его разрушении и энхондроме основной фаланги // Мед. журн. 2015. No 2. С. 155-158.

5. Баева Л.С., Маринин А.А. Современные технологии аддитивного изготовления объектов // Вестник МГТУ. 2014. Т. 17. No 1. С. 7-12.

6. Дудариков С.А., Емец А.Н., Шарофеев А.Н., Семикин Е.Е., Сахарюк А.П., Цыганчук Е.В., Петрищенко Д. Эндопротезирование мелких суставов кисти и стопы // Амурский мед. журн. 2015. No 4. С. 196-198.

7. Михалкевич Д.И., Беспальчук П.И. Эндопротезирование суставов кисти // Мед. журнал. 2015. No 1. С. 143-145.

8. Мурадов М.И., Байтингер В. Ф., Камолов Ф.Ф., Сайк П.Ю., Курочкина О.С. Оценка отдаленных результатов эндопротезирования суставов пальцев кисти // Вопр. реконструкт. и пласт. хир. 2016. Т. 19, No 1. С. 33-41.

9. Щедрина М.А., Новиков А.В., Носов О.Б. Первый опыт реабилитации больных после эндопротезирования суставов кисти // Вопр. травматол. и ортопедии. 2014. No 2. С. 31-35.

10. Дюрягин Н. М. Новая методология и технологии реконструкции нижней челюсти и височно-нижнечелюстного сустава эндопротезами из материалов никелида титана // Омский науч. вестн. 2010. No 1. С. 45-49.

11. Любченко О.Д. Разработка современных материалов для эндопротезирования // Actualscience. 2016. Т. 2, No 7. С. 5-6.