Влияние трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на летальность и продолжительность жизни после обширных резекций печени: экспериментальное исследование

Резюме

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) могут быть клеточным продуктом для профилактики пострезекционной печеночной недостаточности после обширных резекций печени. Для оценки их эффективности необходимо проведение исследований на адекватной экспериментальной модели. Универсальной модели острой печеночной недостаточности в настоящее время не существует. На хирургической модели было показано, что летальность отмечается при резекции >85% паренхимы печени. На данный показатель влияет не только объем резецируемой печени, но и выбор наркоза.

Исследование проведено на 36 крысах-самцах породы Вистар. 1 крыса была использована для получения аллогенных ММСК костного мозга (КМ). Исследование состояло из 2 частей: в 1-й части определяли критический объем на двух группах крыс (по 14 животных в каждой группе), которым выполнена 85 и 90% резекция печени (у 7 крыс применяли внутримышечный наркоз золетилом, у 7 - ингаляционный наркоз изофлураном). Во 2-й части изучали влияние трансплантации аллогенных ММСК КМ на летальность и продолжительность жизни после выполнения критических резекций печени. Исследование проводили на 7 крысах, объем резекции печени которым был установлен в 1-й части настоящей работы и которым интраоперационно трансплантировали 2,5 млн аллогенных ММСК КМ в нижнюю полую вену.

Летальность животных после 85% резекции печени независимо от применяемого наркоза составила 0%, в то время как после резекции 90% печени - 100%. В зависимости от применяемого наркоза медиана продолжительности жизни животных изменялась: после 90% резекции печени и применении в качестве наркоза золетила она составила 12 ч, при изофлурановом наркозе - 48 ч. Трансплантация аллогенных ММСК КМ после 90% резекции печени (внутримышечно наркоз золетилом) не влияла на летальность и продолжительность жизни: все крысы умерли в первые 2 сут после операции, а медиана продолжительности жизни составила 12 ч в обеих группах (р=0,66).

Объем 90% резекции печени является критическим - погибли 100% животных. Наркоз золетилом (в сравнении с изофлураном) уменьшал продолжительность жизни после 90% резекции печени, но не влиял на летальность. Применение аллогенных ММСК КМ после 90% резекции печени не влияет на летальность и продолжительность жизни.

Ключевые слова:обширная резекция печени, трансплантация, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, нижняя полая вена

Для цитирования: Рудаков В.С., Астрелина Т.А., Губарев К.К., Журбин А.С., Светлакова Д.С., Восканян С.Э. Влияние трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на летальность и продолжительность жизни после обширных резекций печени: экспериментальное исследование // Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2019. Т. 7, No 2. С. 31-37. doi: 10.24411/2308-1198-2019-12004.

Статья поступила в редакцию 16.09.2017. Принята в печать 22.04.2019.

Резекция печени - основной метод лечения первичных, метастатических опухолей и паразитарных поражений печени [1-3]. Смертность после обширной резекции печени (ОРП) удалось снизить до 3,2% [2], осложнения, возникающие после выполнения данной операции, остаются на высоком уровне и достигают 47% [2]. Частым осложнением после резекции печени является острая печеночная недостаточность, которая возникает в 33,83% случаев и проявляется нарушением синтетической функции печени, печеночной энцефалопатией, а в ряде случаев даже может привести к смерти [2]. Для решения данной проблемы необходим поиск новых препаратов [4], а оценку их эффективности необходимо проводить на адекватной экспериментальной модели [5].

По данным разных авторов, в эксперименте летальность наблюдается при выполнении >85% резекции печени [6, 7]. На летальность влияет не только объем операции, но и применяемый наркоз, а также введение глюкозы в раннем послеоперационном периоде [8, 9]. В последнее время в экспериментах все чаще внутримышечно применяется в качестве наркоза золетил, его использование описано при 70% резекции печени у крыс [2]. В зарубежных работах препарат золетил применяется крайне редко в отличие от изофлурана [8, 10, 11].

С развитием регенеративной медицины в рамках инициативных исследований при лечении острой печеночной недостаточности (ОПН) стало можно применять клеточные продукты, в частности мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [2]. Показано, что ММСК способны дифференцироваться в гепатоциты и поддерживать их специфичные функции (секреция альбумина, мочевины, накопление внутриклеточного гликогена, липопротеинов низкой плотности) [2]. Нами уже было описано применение аллогенных ММСК костного мозга (КМ) при 70% резекции печени и влияние последних на вес крысы, массу печени, биохимические показатели и коагулограмму [2].

В настоящей работе оценивали влияние трансплантации 2,5 млн аллогенных ММСК КМ на летальность и продолжительность жизни после 90% резекции печени у крыс в эксперименте.

Материал и методы

Исследование выполнено на 36 крысах-самцах породы Вистар массой 155-185 г. Животных содержали в виварии в одинаковых условиях, при постоянной температуре окружающей среды, стандартном лабораторном кормлении. Помещение, в котором находились животные, вентилировалось с постоянным контролированием давления воздуха и температуры, соблюдался суточный цикл (12 ч день/ночь). Накануне операции крыс не кормили, все манипуляции выполняли с 7.30 до 10.30. Крыс выводили из эксперимента декапитацией под внутримышечным наркозом раствором золетила из расчета 15 мг/кг массы тела животного. Эксперимент проводили и завершали в соответствии с требованиями Европейской конвенции "О защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (Страсбург, 1986 г.).

Дизайн исследования. Исследование состояло из двух частей.

1-я часть. Определяли критический объем резекции печени на 2 группах животных (по 14 крыс в каждой). В 1-й группе крысам выполняли резекцию 85% печени, во 2-й группе - резекцию 90% печени. Период наблюдения составил 21 день. В каждой группе 7 крыс получали внутримышечный наркоз золетилом (15 мг/кг) и 7 крыс ингаляционный наркоз изофлураном. Всем крысам интраоперационно вводили 2,5 мл физиологического раствора в нижнюю полую вену (НПВ).

2-я часть. Чтобы определить влияние аллогенных ММСК КМ на летальность и продолжительность жизни животных после критической резекции печени, объем которой установлен в 1-й части настоящей работы, сформирована 3-я группа из 7 животных. Им выполнена критическая резекция печени с одновременным введением 2,5 млн аллогенных ММСК КМ (объем 2,5 мл) в НПВ. Результаты сопоставлены с группой крыс из 1-й части исследования, перенесших такой же объем резекции, но не получивших ММСК КМ.

Протокол операции. Под внутримышечной анестезией раствором золетила из расчета 15 мг/кг веса или под ингаляционным наркозом изофлурана выполняли верхнюю срединную лапаротомию длиной 3-4 см. Срединную и левую латеральную доли печени выводили в рану, долевые сосуды перевязывали у основания и доли удаляли. Удаленная часть составляла 2/(67-70%) от общей массы печени. В дальнейшем при выполнении 85% резекции печени дополнительно выделяли сальниковые доли, правую переднюю долю печени, перевязывали долевые сосуды у основания, доли удаляли (рис. 1) [7]. Для резекции 90% после резекции 67-70% печени выделяли и удаляли правую переднюю и правую заднюю доли печени (см. рис. 1) [6]. После 90% резекции печени в брюшную полость инфузионно вводили раствор 5% глюкозы (из расчета 5% от массы тела), в дальнейшем ежедневно подкожно вводили 5% раствор глюкозы (из расчета 5% от массы тела). Лапаротомный разрез ушивали наглухо непрерывным швом. В течение 7 дней к питьевой воде добавляли сахар (для получения 20% раствора глюкозы). Добавление глюкозы при выполнении запредельных резекций печени необходимо для исключения смерти животных от гипогликемической комы [13].

Рис. 1. Резекция 85% (А) и 90% (Б) печени

Fig. 1. 85% (А) and 90% (B) hepatic resection

Получение ММСК КМ. ММСК были получены из бедренных костей крыс по стандартной методике [12]. Центрифугирование выполняли в течение 7 мин при 300g. Содержание культуральной среды: DMEM + 10% FBS (BI, Израиль) + пенициллин 100 ед/мл + стрептомицин 100 мкг/мл + L-глютамин 2 мл. Для применения ММСК КМ использовали 3 пассажа. Иммунологический фенотип ММСК КМ подтверждали при помощи проточной цитометрии.

Оценка летальности и выживаемости. Летальность и выживаемость оценивали 2 раза в день - в 7.00 и в 19.00 после операции. Летальность оценивали в процентах от общего числа прооперированных в конкретной группе, продолжительность жизни - в часах после операции.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программного обеспечения SPSS 22 для Windows. Данные были проанализированы в соответствии с кривой Каплана-Майера. Показатели выживаемости в различных группах сравнивали с помощью логарифмических ранговых критериев; p<0,05 был выбран как статистически значимый результат.

Результаты

Критический объем резекции печени

При выполнении 85% резекции печени независимо от применяемого наркоза (золетил/изофлуран) все крысы прожили 21 сут. Крыс вывели из эксперимента на 21-е сутки после операции (рис. 2).

При выполнении резекции 90% печени отмечена 100% летальность. Все животные погибли в течение первых 13 сут после операции (рис. 3, 4). Таким образом, 90% резекция печени является критической для жизни животного. Для второй части исследования выбрана данная экспериментальная модель.

Рис. 3. Печень крысы на разные сроки после 90% резекции печени

Fig. 3. Rat liver for different timescales after 90% hepatic resection


Рис. 4. Определение критического объема резекции печени и влияние аллогенных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга на летальность и продолжительность жизни после выполнения запредельных резекций печени

Fig. 4. Determination of the critical volume of hepatic resection and influence of allogeneic multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells on mortality and lifetime after performing out-of- limit hepatic resections

При дополнительном анализе животных из 2-й группы, выявлено влияние наркоза на продолжительность жизни животного, медиана 12 и 48 ч при наркозе золетилом и изофлураном соответственно (p=0,002). Таким образом, в ходе исследования выявлено влияние наркоза на продолжительность жизни, что требуется учитывать при планировании эксперимента.

Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на летальность и продолжительность жизни после критической резекции печени

Для изучения влияния клеточного продукта на летальность и выживаемость после 90% резекции печени выбран наркоз золетилом как более простой, безопасный и удобный в применении и в то же время не оказавший влияние на летальность (см. описание 1-й части данного исследования).

Животным 3-й группы выполнена трансплантация аллогенных ММСК КМ в НПВ. Летальность к 21-м суткам составила 100%. Результаты пред- ставлены на рис. 4. Медиана времени жизни со- ставила 24 и 12 ч (p=0,11) для животных 2-й и 3-й групп соответственно.

Дополнительное сравнение 3-й группы с 7 крысами из 2-й группы, получивших наркоз золетилом: животные обеих групп прожили не более 48 ч, значимых различий в летальности и во времени жизни не выявлено, медиана жизни - 12 ч в обеих группах (p=0,66). Таким образом, трансплантация ММСК не влияет на продолжительность жизни после резекции 90% печени.

Обсуждение

По данным литературы, резекция >85% паренхимы печени сопровождается летальностью от 60 до 100% [6-8, 10, 11]. На летальность влияет не только объем операции, но и наркоз, а также применение глюкозы в раннем послеоперационном периоде [8, 9]. В ранее выполняемых работах не изучали влияния наркоза золетилом на летальность и продолжительность жизни после 85 и 90% резекций печени.

В нашей работе после выполнения 90% резекции печени все животные погибали независимо от применяемого наркоза. Однако при проведе- нии дополнительного статистического сравнения отмечено увеличение продолжительности жизни животного при использовании изофлуранового наркоза по сравнению с наркозом золетилом (48 против 12 ч, р=0,02).

По данным литературы, после резекции 90% печени под изофлурановым наркозом летальность колебалась от 75,3 до 100% [8, 10, 11]. В разных исследованиях использовали различные сроки вывода животных, виды наркоза и количество животных [7, 10, 11, 14]. Влияние наркоза на летальность отмечали и другие авторы при анализе применения наркозов кетамином и изофлураном на модели с резекцией 90% печени [8]. При использовании в качестве наркоза этаминал-натрия и резекции 85% печени отметили 60% летальность [7].

Применяемый наркоз непосредственно влияет на результаты исследования, это необходимо учитывать при выборе экспериментальной модели, анализе литературы и оценке полученных результатов.

В нашем исследовании летальность на 21-е сутки после 85% резекции печени составила 0% вне зависимости от применяемого наркоза (золетил/ изофлуран). Таким образом, модель с 85% резекцией печени и применением в качестве наркоза золетила или изолурана не подходит для оценки летальности, однако данную модель можно использовать для оценки функциональных показателей и морфологии печени на длительных сроках после операции.

Для оценки эффективности трансплантации аллогенных ММСК КМ была выбрана модель с 90% резекцией печени. Статистической значимой разницы в показателях летальности и продолжительности жизни между группами с введением клеток и без введения не выявлено. В большинстве зарубежных работ при трансплантации классических ММСК после резекции 90% печени не отмечено статистически значимых изменений в летальности [8, 10]. Статистически значимые отличия в данных показателях наблюдали при предварительной подготовке данных клеток (преддифференцировка в гепатоцитоподобные клетки, инкапсулирование, предварительная гипоксия) [7, 10, 11]. Таким образом, предварительно не подготовленные ММСК не влияют на летальность после резекции 90% печени.

Заключение

Выполнение резекции печени в объеме 90% при использовании в качестве наркоза золетила или изофлурана является критичным для жизни животного, в результате чего все животные погибают. При планировании эксперимента важно выбирать не только адекватную экспериментальную модель, но и наркоз. Внутримышечный наркоз золетилом по сравнению с ингаляционным наркозом изофлураном при выполнении 90% резекции печени ухудшает выживаемость, но не влияет на летальность. Трансплантация аллогенных ММСК КМ после 90% резекции печени не влияет на летальность и продолжительность жизни. Для более полного понимания механизмов терапевтического действия ММСК и улучшения их терапевтического действия при пострезекционной печеночной недостаточности необходимо проведение дополнительных исследований.

Финансирование. Исследование проведено за счет средств ФГБУ "Государственный научный центр - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна" ФМБА России.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Восканян С.Э., Артемьев А.И., Найденов Е.В.,Забежинский Д.Аи дрТрансплантационные технологии в хирургии местнораспространенного альвеококкоза печени с инвазией магистральных сосудов //Анналы хиргепатологии. 2016. Т. 21, No 2. С. 25-32.

2. Рудаков В.С., Восканян С.Э., Еремин И.И., Онницев И.Еи дрЭкспериментальное исследование мультипотентных стромальных клеток в лечении острой печеночной недостаточности при обширной резекции печени // Гены и клетки. 2016. Т. 11, 4. С. 90-100.

3. Ким Э.Ф., Филин А.В., Семенков А.В., Ушакова И.Аи дрДвухэтапная обширная резекция печени при гепатобластомепервый отечественный опыт //Клини эксперхирЖурнимБ.ВПетровоского. 2013. No 2. С. 28-35.

4. Восканян С.Э., Найденов Е.В., Артемьев А.И.,Забежинский Д.Аи дрСравнительные результаты применения гепатопротекторов для профилактики печеночной недостаточности при обширных резекция печени // ХирургияЖурнал имН.ИПирогова. 2016.No 9. С. 71-75.

5. Рудаков В.С., Восканян С.Э., Еремин И.И.,Деев Р.ВЭкспериментальные модели острой печеночной недостаточности // Росмед.-биолвестнимакад.И.ППавлова. 2015. No 4. С. 138-144.

6. Uribe-Cruz C., Kieling C.O., López M.L., Osvaldt A. et al. Encapsulated whole bone marrow cells improve survival in Wistar rats after 90% partial hepatectomy // Stem Cells Int. 2016. Vol. 7. P. 1-9.

7. Yu J., Yin S., Zhang W., Gao F. et al. Hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells promote liver regeneration in a rat massive hepatectomy model // Stem Cell Res. Ther. 2013. Vol. 4. P. 83.

8. Kieling C.O., Backes A.N., Maurer R.L., Cruz C.U. et al. The effects of anesthetic regimen in 90% hepatectomy in rats // Acta Cir. Bras. 2012. Vol. 27, N 10. P. 702-706.

9. Matsuda M., Kato K., Mito M. [Effect of RES on liver regeneration and survival after 90% partial hepatectomy] // Nihon Geka Gakkai Zasshi. 1994. Vol. 95, N 9. P. 662-668.

10. Liu Z.C., Chang T.M. Intrasplenic transplantation of bioencapsulated mesenchymal stem cells improves the recovery rates of 90% partial hepatatecromized rats // Stem Cells Int. 2012. Vol. 2012. Article ID 697094. P. 1-6.

11. Miyazaki M., Hardjo M., Masaka T., Tomiyama K. et al. Isolation of a bone marrow-derived stem cell line with high proliferation; potential and its application for preventing acute fatal liver failure // Stem Cells. 2007. Vol. 25. P. 2855-2863.

12. Sun X.E., Zhang X.Q., Liu M.M. Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the TGF-B1/Smad signaking pathway of hepatic stellate // Genet. Mol. Res. 2015. Vol. 14. P. 8744-8754.

13. Gaub J., Iversen J. Rat liver regeneration after 90% partial hepatectomy // Hepatology. 1984. Vol. 4, N 5. P. 902-904.

14. Yamamoto T., Navarro-Alvarez N., Soto-Gutierrez A., Yuasa T. et al. Treatment of acute liver failure in mice by hepatocyte xenotransplantation // Cell Transplant. 2010. Vol. 19, N 6. P. 799-806.