Мутации в генах ионных каналов при гипертрофической кардиомиопатии

Резюме

Актуальность. Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) - наследственное заболевание миокарда, причиной которого являются мутации в генах саркомерных белков. Заболевание характеризуется гетерогенным фенотипом, изменчивой внутри- и межсемейной экспрессивностью и неполной пенетрантностью. Такая вариабельность заболевания может свидетельствовать о наличии других генетических факторов, так называемых генов-модификаторов, в том числе кодирующих белки ионных каналов и ассоциируемых с жизнеугрожающими желудочковыми аритмиями.

Цель данного исследования - поиск мутаций в генах белков саркомеров и ионных каналов у пациентов с ГКМП и изучение клинических проявлений заболевания в зависимости от генотипа.

Материал и методы. В исследование были включены 78 неродственных белорусских пациентов с высоким риском внезапной сердечной смерти (ВСС). Генотипирование осуществляли с использованием набора реагентов TruSight Cardio Sequencing Kit (Illumina).

Результаты. У 13 (16,7%) пациентов с ГКМП были обнаружены редкие мутации в 5 генах ионных каналов:  KCNQ1 (4), KCNH2 (3), CACNA1C (4), SCN5A (1) и ANK2 (2), из них 28,6% мутаций патогенные, 57,1% - VUS, 14,3% - новые, патогенные по предикторам in silico. Только 7 из 13 пациентов имели мутации в саркомерных генах (4 патогенных и 3 VUS). Показано, что присутствие мутаций в генах ионных каналов у пациентов с ГКМП в сочетании с изменениями в генах саркомерных белков провоцирует раннюю манифестацию заболевания, а также неза- висимо от наличия мутаций в генах саркомерных белков увеличивает риск ВСС.

Заключение. Наличие мутаций в генах ионных каналов у пациентов с ГКМП увеличивает риск развития жизнеугрожающих аритмий и ВСC и влияет на их прогноз и лечение.

Ключевые слова:гипертрофическая кардиомиопатия, мутации, гены белков саркомеров, каналопатии, гены ионных каналов, высокопроизводительное секвенирование (NGS), фенотипические проявления

Для цитирования: Чакова Н.Н., Комиссарова С.М., Ниязова С.С. Мутации в генах ионных каналов при гипертрофической кардиомиопатии // Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2019. Т. 7, No 3. С. 63-69. doi: 10.24411/2308-1198-2019-13007
Статья поступила в редакцию 15.06.2019. Принята в печать 25.07.2019.

Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) - одна из самых распространенных генетически детерминированных кардиомиопатий, которая выявляется примерно в 1 из 200 случаев среди взрослого населения и может быть причиной внезапной сердечной смерти (ВСС) или прогрессирующего ухудшения систолической и диастолической функции левого желудочка [1]. На данный момент многочисленными исследованиями установлено и подтверждено, что у 50-60% пациентов данное заболевание вызывается мутациями в генах, кодирующих саркомерные белки кардиомиоцитов, и наследуется по аутосомно-доминантному типу. Еще 5-10% пациентов с ГКМП имеют метаболические синдромальные нарушения, нервно-мышечные болезни и генетические мальформации, обусловленные нарушениями в несаркомерных генах [2]. В ряде публикаций сообщается, что в редких случаях мутации в генах ионных каналов также могут лежать в основе неаритмических фенотипов и проявляться в виде структурных заболеваний сердца, включая различные кардиомиопатии и врожденные пороки сердца, или иметь перекрывающийся фенотип [3].

Благодаря высокопроизводительному секвенированию появляется все больше данных о наличии у пациентов с ГКМП нескольких патогенных мутаций, причем все они могут быть локализованы как в генах саркомерных белков, так и в разных генах, включая гены ионных каналов. В этих случаях речь идет о модифицирующем влиянии мутаций в несаркомерных генах на течение заболевания и его прогноз [4, 5]. Как известно, ГКМП характеризуется высокогетерогенным фенотипом, изменчивой внутри- и межсемейной экспрессивностью и неполной пенетрантностью. Одной из причин такой фенотипической изменчивости заболевания может быть вклад генов-модификаторов. Полученные на данный момент данные являются скорее предварительными и требуют дальнейшего изучения путем накопления аналогичных случаев и долгосрочного наблюдения.

Цели данного исследования - поиск мутаций в генах, кодирующих белки саркомеров и ионных каналов, у пациентов с ГКМП и изучение клинических проявлений заболевания в зависимости от генотипа.

Материал и методы

В исследование были включены 78 неродственных белорусских пациентов с ГКМП из регистра обследованных и проспективно наблюдаемых в Республиканском научно-практическом центре "Кардиология" в течение 7 лет. Все участники подписали информированное согласие на использование соответствующих биоматериалов для научных исследований. Диагноз ГКМП устанавливался в соответствии с рекомендациями Международного комитета экспертов по ГКМП (ESC, 2014).

Помимо физикального обследования всем пациентам выполняли эхокардиографию (ЭхоКГ) согласно объединенным рекомендациям Американского эхокардиографического общества и Европейской ассоциации эхокардиографии по количественной оценке структуры и функции камер сердца, электрокардиографию (ЭКГ) в 12 отведениях, суточное мониторирование ЭКГ, при необходимости коронароангиографию и магнитно-резонансную томографию (МРТ) сердца с отсроченным контрастированием гадолинием. В исследуемую группу вошли неродственные пациенты с высоким риском ВСС, в том числе умершие вследствие ВСС (8 человек), имеющие в семейном анамнезе случаи внезапной смерти близких родственников в молодом возрасте (21 человек); с успешной реанимацией и имплантацией кардиовертера-дефибриллятора (4 человека), с наличием желудочковых тахиаритмий (38 человек). Средний возраст нерод- ственных пациентов с ГКМП при первоначальной оценке составлял 38,8±12,6 лет (17-63), 54 (69,2%) мужчины. Среднее значение толщины межжелудочковой перегородки (ТМЖП) - 19,7±4,1 мм.

Выделение тотальной ДНК из замороженной цельной крови выполняли фенол-хлороформным методом [6]. Поиск мутаций в кодирующих последовательностях генов у 78 пациентов проводили методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) на генетическом анализаторе MiSeq (Illumina). Пробоподготовку образцов для секвенирования на приборе MiSeq выполняли с использованием набора TruSight Cardio Sequencing Kit (Illumina), включающего гены-кандидаты для кардиомиопатий и каналопатий. Обработку и аннотирование результатов секвенирования проводили с помощью специального программного обеспечения ANNOVAR rev. 527 [7], позволяющего оценить патогенность выявленного генетического варианта на основе баз данных dbSNP, 1000 genomes, GWAS, HGMD и предсказательных модулей PolyPhen-2 и SIFT, REVEL, FATHMM.

Для верификации результатов NGS проводилась проверка наличия мутаций в исследуемых генах с помощью автоматического секвенирования по Сен- геру. Секвенирование выполняли с использованием коммерческого набора Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Последовательности использованных в работе праймеров, условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и список рестриктаз доступны по запросу.

Статистическую обработку материала проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0. Две несвязанные между собой группы по количественным признакам сравнивали непараметрическим методов с использованием U-критерия Манна-Уитни. Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического значения и стандартного отклонения. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведения секвенирования у 51,3% пациентов (40 из 78) были выявлены генетические изменения в 6 генах, кодирующих саркомерные белки: ACTC1, MYBPC3, MYH7, MYL3, TNNС1 и TPM1. Из 46 обнаруженных генетических изменений большинство - 84,8% (39 из 46) - находились в генах MYH7 (15) и MYBPC3 (24). У 6,4% индивидуумов было обнаружено по 2 (5,1%) или по 3 (1,3%) замены, причем хотя бы одна из них находилась в гене MYBPC3. Патогенные мутации составили 78,3% (36 из 46), остальные имели статус возможной клинической значимости (variant of uncertain significance - VUS); 15,2% (7 из 46) мутаций обнаружены впервые.

Кроме того, у 13 из 78 (16,7%) пациентов с ГКМП были обнаружены патогенные мутации или аллельные варианты с возможной клинической значимостью в 5 генах, ответственных за функционирование ионных каналов (БК): KCNQ1 (4 мутации), KCNH2 (3 мутации), CACNA1C (4 мутации),SCN5A (1 мутация) и ANK2 (2 мутации).

Как показано на рис. 1, у половины пациентов с мутациями в этих генах (БК) не обнаружено мутаций в генах саркомерных белков (БС), при этом у 1 пациента наблюдалась комбинация мутаций в генах CACNA1C и ANK2. У остальных пациентов на- ряду с мутациями, ассоциируемые с наследственными аритмиями, отмечались мутации и в генах саркомерных белков (БК + БС) (рис. 1).

28,6% (4 из 14) мутаций в генах ионных каналов приходились на патогенные мутации; 57,1% - VUS; 14,3% (2 из 14) - новые, патогенные по предикторам in silico. При этом только 4 из этих пациентов имели патогенные мутации в саркомерных генах, 3 пациента имели замены со статусом VUS и у 6 пациентов мутаций в саркомерных генах не выявлено (табл. 1).

78,6% мутаций в генах ионных каналов приходилось на 3 гена: KCNQ1 и KCNH2, кодирующих α-субъединицы медленных и быстрых калиевых каналов, и CACNA1C, отвечающего за синтез α1-субъединицы кальциевого канала. Интересно, что у 3 из 4 (75,0%) носителей мутации в гене CACNA1C не выявлено мутаций в генах саркомерных белков, т.е. мутации в этом гене, повидимому, были основной причиной развития ГКМП. Возможно, это связано с нарушением регуляции ионов внутриклеточного Са2+, который, как известно, является основным модулятором сокращения и релаксации миоцитов и может активировать гипертрофию и дисфункцию миокарда, подверженного стрессовому воздействию [8]. Нарушение обмена Са2+ в целом и повышение его концентрации внутри клетки являются центральными механизмами в патогенезе ГКМП [9]. Наиболее интересный случай в этом отношении представляла пациентка с мутацией p.Arg518Cys (rs786205748) в гене CACNA1C. Данная мутация является патогенной, была обнаружена в нескольких семьях и на данный момент хорошо представлена в литературе [10]. Ее фенотипическая реализация даже в одной и той же семье очень широка: от ГКМП, жизнеугрожающих аритмий, врожденных пороков сердца до случаев ВСС, а также сочетание этих клинических фенотипов.

Для изучения клинических проявлений ГКМП в зависимости от обнаруженного генотипа все пациенты (78 человек) были разделены на 4 группы: 1-я - пациенты без значимых мутаций в генах саркомерных белков и ионных каналов; 2-я - пациенты с мутациями только в генах саркомерных белков (БС); 3-я - пациенты с мутациями только в генах ионных каналов (БК) и 4-я - пациенты с комбинацией мутаций в генах саркомерных белков и ионных каналов (БС + БК). Клиническая характеристика пациентов в зависимости от генотипа представлена в табл. 2.

Сравнительный анализ между исследуемыми выборками показал, что пациенты из 4-й группы с сочетанием мутаций имели самый молодой воз- раст манифестации первичных симптомов, а также наибольшую частоту эпизодов неустойчивой желудочковой тахикардии (57,1%) по данным холтеровского мониторирования ЭКГ, случаев успешной реанимацией с имплантацией кардиовертера-дефибриллятора (28,6%) и ВСС у родственников в анамнезе (42,9%) по сравнению с другими группами. Полученные результаты подтверждаются исследова- ниями L.R. Lopes и др. [5], в которых представлены генотип- и фенотип-ассоциации у пациентов с ГКМП и продемонстрировано, что пациенты с сочетанием мутаций в генах белков саркомера и ионных каналов имели злокачественные аритмии.

У носителей мутаций только в генах, ассоциируемых с каналопатиями, возраст проявления первичных симптомов оказался самым поздним по сравнению с остальными группами и составил 48,8±9,3 года. Однако у пациентов этой группы в 100% случаев диагностирована более тяжелая обструктивная форма ГКМП, а случаи ВСС регистрировались в 5 раз статистически значимо чаще, чем в других группах (р=0,008).

Что касается показателей гипертрофии миокарда (ИММ, ТСЛЖ макс.), их степень выраженности больше зависела от наличия мутаций в генах саркомерных белков.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что присутствие мутаций в генах ионных каналов у пациентов с ГКМП в сочетании с мутациями в генах саркомерных белков провоцирует раннюю манифестацию ГКМП и независимо от наличия мутаций в генах саркомерных белков увеличивает риск ВСС.

Клинический случай

Поскольку семейный скрининг позволяет вы- явить особенности фенотипических проявлений заболевания более детально, чем выборка неродственных пациентов, в качестве клинического примера приводим семью, в которой у 4 ее членов были выявлены 2 мутации p.Asp610His (rs371564200) и p.Pro1066Arg (новая) в гене MYBPC3 и мутация p.Arg885Cys (rs143512106) в гене KCNH2 в различном сочетании, при этом фенотипы очень сильно различались (табл. 3, рис. 2).

Рис. 2. Родословная семьи пациентки с 3 мутациями (- нет признаков ГКМП, - диагностирована ГКМП,- установлена зона некомпактного миокарда, ± - наличие/ отсутствие мутации, ВСС - внезапная сердечная смерть)

Fig. 2. Pedigree of the patient with 3 mutations (- clinically unaffected members,- clinical diagnosis of HCM,- clinical diagnosis of left ventricularnoncompaction, ± - mutation present/ absent, ВСС - sudden cardiac death)

У пробанда, 28-летняя женщины с 3 выявленными мутациями, течение заболевания было самым тяжелым, симптомы заболевания манифестировали в течение последних 5 лет, когда появилась одышка при умеренной физической нагрузке и перебои в сердце (табл. 3). При ЭхоКГ выявили асимметричную гипертрофию ЛЖ с максимальной толщиной межжелудочковой перегородки в базальном отделе 24 мм без обструкции выносящего тракта ЛЖ. При суточном мониторировании ЭКГ регистрировали синусовый ритм с частой желудочковой экстрасистолией и эпизодами НЖТ. Медикаментозное лечение включало бисопролол в дозе 5 мг/сут. В возрасте 26 лет у пациентки внезапно произошла пароксизмальная желудочковая тахикардия/фибрилляция желудочков (ЖТ/ФЖ) с успешной реанимацией и имплантацией кардиовертера-дефибриллятора. На ЭКГ было зарегистрировано удлинение интервала QT 480 мс.

При каскадном скрининге было установлено, что мутацию p.Pro1066Arg в гене MYBPC3 и мутацию p.Arg885Cys в гене KCNH2 пробанд унаследовала от отца (рис. 2), у которого диагностирована необструктивная ГКМП (градиент давления ВТЛЖ 27 мм рт.ст.), асимметричная гипертрофия ЛЖ (толщина межжелудочковой перегородки - 18 мм, толщина задней стенки ЛЖ - 11 мм) без значимых нарушений ритма. У матери при генотипировании установлена мутация p.Asp610Asn. При ЭхоКГ признаки ГКМП отсутствовали, выявлена зона некомпактного миокарда в верхушечной области ЛЖ. При суточном мониторинге ЭКГ значимых нарушений ритма не регистрировали. Сын пробанда (7 лет) является носителем мута- ции p.Asp610Asn, на данный момент симптомов заболевания нет.

Таким образом, более тяжелые клинические проявления заболевания были у членов семьи, у которых помимо одной или двух мутаций в гене MYBPC3 была выявлена также мутация p.Arg885Cys в гене KCNH2: они имели более выраженную гипертрофию ЛЖ и неблагоприятные события. Можно предположить, что мутация в гене KCNH2 служит функциональным модификатором ГКМП, причиной которого являются мутации в саркомерном гене MYBPC3.

Заключение

ГКМП - это болезнь со сложным патогенезом, в основе которого лежит нарушение структуры саркомера и энергетический дефицит, детерминированные прежде всего генетическими дефектами. В данном исследовании установлено, что дополнительные мутации в генах ионных каналов могут являться генетическими модификаторами клинических проявлений ГКМП и провоцировать более выраженный фенотип и неблагоприятные исходы по сравнению с пациентами с мутацией только в генах саркомерных белков. Наряду с модифицирующим эффектом некоторые мутации в генах ионных каналов могут быть непосредственной причиной развития ГКМП, в первую очередь, как показывают результаты исследования, это касается мутаций в гене CACNA1C.

Следует отметить, что распространенность мутаций в генах ионных каналов в обследованной выборке пациентов с ГКМП составила 16,0% и была значительно выше, чем ожидалось. Возможно, это было связано с тем, что исследуемая группа была представлена преимущественно пациентами с неблагоприятными событиями и исходами.

Таким образом, наличие мутаций в генах, кодирующих белки ионных каналов, у пациентов с ГКМП ухудшает прогноз заболевания и увеличивает риск ВСС. Результаты данного исследования показывают, что пациентам с диагнозом ГКМП, имеющим жизнеугрожающие нарушения ритма или неблагоприятные события и исходы в семейном анамнезе, может быть рекомендован поиск мутаций не только в генах саркомерных белков, но и в генах, контролирующих функционирование ионных каналов. Это будет способствовать более точной оценке риска ВСС для пациента и его ближайших родственников и назначению оптимальной терапии с учетом генетических особенностей пациента.

Финансирование. Работа выполнена в рамках мероприятия 18 "Разработать технологию оценки риска внезапной сердечной смерти и других неблагоприятных исходов у пациентов с первичными кардиомиопатиями с использованием технологий нового поколения секвенирования" подпрограммы 1 "Инновационные биотехнологии - 2020" ГП "Наукоемкие технологии и техника", 2016-2020 гг.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литература

1. Elliott P.M., Anastasakis A., Borger M.A., et al. 2014 ESC Guidelines on diagnosis and management of hypertrophic cardiomyopathy: the Task Force for the Diagnosis and Management of Hypertrophic Cardiomyopathy of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J. 2014; 35: 2733-79.

2. Maron B.J., Maron M.S., Semsarian C. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy after 20 years: clinical perspectives. J Am Coll Cardiol. 2012; 60: 705-15.

3. Roston T.M., Cunningham T., Lehman A., et al. Beyond the electrocardiogram: mutations in cardiac ion channel genes underlie nonarrhythmic phenotypes. Clin Med Insights Cardiol. 2017; 11: 1179546817698134.

4. Lopes L.R., Zekavati A., Syrris P., et al. Genetic complexity in hypertrophic cardiomyopathy revealed by high-throughput sequencing. J Med Genet. 2013; 50 (4): 228-39.

5. Lopes L.R., Syrris P., Guttman O.P., et al. Novel genotype-phenotype association demonstrated by high-throughput sequencing in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 2015; 101: 294-301.

6. Mathew C.G. The isolation of high molecular weight eucaryotic DNA. Methods Mol Biol. 1985; 2: 31-4.

7. Wang K., Li M., Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-through- put sequencing data. Nucleic Acids Res. 2010; 38 (16): e164.

8. Backs J., Backs T., Neef S., et al. The delta isoform of CaM kinase II is required for pathological cardiac hypertrophy and remodeling after pressure overload. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 2342-7.

9. Lan F., Lee A.S., Liang P., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2013; 12 (1): 101-13.

10. Boczek N.J., Ye D., Jin F., et al. Identification and functional characterization of a novel CACNA1C-mediated cardiac disorder characterized by prolonged QT intervals with hypertrophic cardiomyopathy, congenital heart defects, and sudden cardiac death. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2015; 8 (5): 1122-32.

11. Garg P., Oikonomopoulos A., Chen H., et al. Genome editing of induced pluripotent stem cells to decipher cardiac channelopathy variant. J Am Coll Cardiol. 2018; 72 (1): 62-75.