Использование siРНК в терапии кардиоваскулярных заболеваний

Резюме

РНК-интерференция - широко-распространенный и эффективный способ целевого подавления экспрессии генов с использованием малых некодирующих РНК. Применение данного механизма для ген-направленной терапии является перспективным инструментом по лечению различного рода заболеваний. И хотя на сегодняшний день в клинической практике не существует препаратов, действие которых основано на механизме РНК-интерференции, в литературе описано большое количество исследований, доказывающих эффективность данного вида терапии in vivo на модельных животных. Существует 3 основных стратегии ген-направленной терапии, основанной на РНК-интерференции: внедрение в клетку экзогенной siРНК для подавления экспрессии целевых генов, увеличение экспрессии существующей в клетке полезной микроРНК и применение блокаторов микроРНК с целью подавления экспрессии эндогенных патогенных микроРНК. В настоящее время основной проблемой внедрения технологии РНК-интерференции в клинику является вопрос доставки малых молекул РНК в целевые клетки. Данный обзор посвящен описанию механизма действия и использования ген-направленной терапии, основанной на механизме РНК-интерференции, для лечения различных сердечно-сосудистых заболеваний.

Ключевые слова:ген-направленная терапия, РНК- интерференция, малые интерферирующие РНК (siРНК), терапия сердечно-сосудистых заболеваний

Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. - 2014. - № 4. - С. 12-19.

В научном мире существуют обоснованные ожидания, что ген-направленная терапия в будущем способна вытеснить большинство, если не все лекарственные средства, существующие на сегодняшний день. Действительно, в возможности влиять на экспрессию целевых генов лежит колоссальный потенциал для лечения заболеваний. Одним из самых известных подходов ген- направленной терапии является использование антисмысловых технологий [49]. В основе антисмысловых технологий лежит принцип комплементарного взаимодействия препарата с РНК-мишенью целевого (таргетного) гена. Данная технология обладает очевидным преимуществом по сравнению со всеми другими - высокой специфичностью действия к выбранной мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСОН) и малые интерферирующие РНК (siРНК) являются самыми распространенными вариантами антисмысловой регуляции экспрессии генов.

В 1978 г. благодаря П. Замечнику и М. Стефенсону началась эра антисмысловой терапии в живых клетках [43]. В своем эксперименте на культуре куриных фибробластов, зараженных вирусом саркомы Рауса, авторы добавили 13-членный синтетический олигонуклеотид, комплементарный 3’-концу этого вируса, что привело к подавлению инфекционного процесса и предотвращению трансформации фибробластов в клетки саркомы. Таким образом, впервые было показано, что антисмысловые олигонуклеотиды (АСОН) могут специфично ингибировать экспрессию генов. С тех пор действие различных АСОН было многократно исследовано in vitro и в экспериментах с животными, при этом были получены весьма обнадеживающие результаты.

Открытие РНК-интерференции произошло 15 лет назад, и ее дальнейшее изучение привело к революции в молекулярной генетике в частности и в биологии в целом [25]. Основным триггером активации РНК-интерференции являются малые РНК, представляющие собой двухцепочечные фрагменты РНК длиной 21-24 нуклеотидных пары. Явным преимуществом технологии РНК-интерференции оказалась ее высокая эффективность, которая примерно в 100 раз выше, чем при применении АСОН [33]. За это время механизм РНК- интерференции был хорошо изучен и стал активно применяться во многих областях для подавления экспрессии генов.

Однако повсеместного внедрения антисмысловых технологий в клинику пока еще не произошло. Несмотря на успешное использование РНК-интерференции и АСОН в фундаментальной науке для влияния на экспрессию целевых генов, успешных попыток применения их в терапии заболеваний пока не так много. Самой главной и пока еще не решенной проблемой является специфичная доставка антисмысловых молекул в целевые клетки in vivo.

Механизмы РНК-интерференции

РНК-интерференция - это механизм специфического посттранскрипционного подавления экспрессии гена, опосредованный малыми молекулами РНК, к которым относятся эндогенные микроРНК и экзогенные малые интерферирующие РНК (siRNA). Образование малых РНК связано с активностью белка Dicer, который расщепляет длинные двухцепочечные РНК и шпилечные структуры премикроРНК с образованием малых интерфирирующих РНК (siRNA) и зрелых микроРНК. [10]. Образующиеся зрелые молекулы малых РНК могут распознаваться и связываться с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), в составе которого они комплементарно связываются со своими РНК-мишенями. При этом для siRNA характерна полная комплементарность мишени, что приводит к расщеплению последней примерно в середине цепи siRNA и дальнейшей деградации [32]. В то же время для молекул микроРНК чаще характерна неполная комплементарность между микроРНК и целевой последовательностью, что приводит к репрессии инициации трансляции и/или ускорению деградации РНК-мишени [37].

Помимо комплекса RISC малые РНК могут распознаваться другим белковым комплексом, RITS (RNA-induced transcriptional silencing), с помощью которого малые РНК могут подавлять экспрессию генов на уровне транскрипции путем ремоделирования хроматина [41]. В клетках млекопитающих транскрипционный генный сайленсинг и последующее метилирование хроматина происходят в ответ на введение экзогенных siRNA, комплементарных генным промоторам [40, 42].

Однако оказалось, что механизм транскрипционного генного сайленсинга не всегда реализуется. В каких-то случаях выполняется противоположный по эффекту механизм РНК-опосредованной активации гена (RNA-mediated gene activation). Как было показано, siRNA, комплементарная к про- моторному участку, в точке инициации транскрипции гена может приводить к активации транскрипции гена, увеличивая ее в несколько раз [21].

Доставка малых РНК

Как уже было отмечено выше, основной проблемой внедрения технологии РНК-интерференции в клинику является вопрос доставки малых молекул РНК в целевые клетки. Существующие на сегодняшний день системы доставки siРНК подразделяются на 2 большие группы - вирусные и невирусные. В случае вирусной доставки создается специальная генно-инженерная конструкция, способная экспрессировать шпилечную РНК, из которой уже клеточными ферментами транскрибированная РНК созревает до siРНК. Такая вирусная доставка siРНК чрезвычайно эффективна [16], она обеспечивает продолжительный эффект, наблюдаемый в течение нескольких месяцев. Но при этом существует ряд негативных факторов, присущий всем вирусным системам доставки: потенциальная канцерогенность, способность индуцировать иммунный ответ, а также другие, например, высокая стоимость производства [29]. Все это заставляет исследователей больше уделять внимания системам невирусной доставки siРНК, которых на сегодняшний день описано очень много [47, 48].

Невирусная доставка siРНК в клетки-мишени получила более широкое распространение в первую очередь за счет простоты и доступности использования данной технологии в различных областях фундаментальной и прикладной науки. Определение гена-мишени, дизайн siРНК, олигонуклеотидный синтез в коммерческой компании, трансфекция siРНК - все это простые экспериментальные этапы, доступные каждому ученому и даже студенту. Такая возможность получения информации о функции гена за счет выключения его экспрессии (gene knockdown) оказалась финансово доступной и быстрой по времени. Основным отличием данного подхода от использования вирусной доставки является кратковременный наблюдаемый эффект - не более недели.

Существующие в настоящий момент способы невирусной доставки siРНК в клетки-мишени можно разделить на 2 основные группы: доставка siРНК без оболочки со стабилизирующими модификациями и в оболочке. Доставка siРНК без оболочки широко использовалась на ранних этапах исследований явления РНК-интерференции [17, 19]. Но оказалось, что незащищенные, или безоболочечные, siРНК (naked siRNA) проявляли низкую эффективность действия на гены-мишени в первую очередь за счет нестабильности при действии цитоплазматических и внеклеточных РНКаз, а также за счет низкого уровня интернализации siРНК клетками и способности запускать иммунный ответ. Поэтому были разработаны различные способы химических модификации, позволяющие повысить стабильность и липофильность таких siРНК, а также снизить их способность к иммунной стимуляции [19]. Среди наиболее распространенных модификаций хочется выделить замещение фосфодиэфирной связи на более устойчивую к действию нуклеаз фосфотиоатную [18], защита 2-гидроксильных групп [20], использование заблокированных нуклеиновых кислот (LNA - locked nucleic acids) [23], конъюгацию siРНК с пептидами, проникающими в клетку (cell penetrating peptides - CPPs). Таких модификаций сегодня описано много, и они подробно были рассмотрены нами ранее [48].

Второй вариант доставки с оболочкой также можно разделить на 2 основные группы: оболочка, состоящая из органических материалов или из неорганических. В настоящее время неорганические носители распространены мало, большая часть исследований с их использованием проводилась in vitro. Органические носители siРНК, наоборот, хорошо изучены и широко применяются, в том числе и для исследований in vivo. Большая часть таких носителей была разработана еще в конце прошлого столетия и применялась для доставки ДНК в клетки. Позднее этот опыт был использован и в работах с siРНК. Органические системы доставки включают липидные и полимерные носители, которые в свою очередь также имеют подвиды, причем каждый из них обладает рядом преимуществ и недостатков [47].

Хочется также отметить, что вопрос разработки способов эффективной доставки siРНК до сих не решен. При выборе подходящей системы исследователь может учитывать различные параметры, отображающие свойства систем доставки: размер, поверхностный заряд, адресность, способы введения siРНК in vivo, совместимость с компонентами крови, стабильность [47].

Помимо доставки siРНК in vivo, так широко востребованной и активно разрабатываемой сегодня, существуют более простые и успешные варианты локальной доставки. Самый известный и успешный пример посвящен разработке препарата на основе siRNA для лечения возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причины потери зрения у пожилых. Причина ангиогенеза при влажной форме ВМД - экспрессия фактора роста эндотелия VEGF, являющегося ключевым лигандом для сигнального каскада, приводящего к образованию и росту кровеносных сосудов. В стимуляции ангиогенеза также может участвовать и рецептор VEGFR-1, находящийся на поверхности клеток эндотелия сосудов, лигандом к которому может быть как сам VEGF, так и плацентарный фактор роста (PlGF).

В разработке лекарства на основе анти-VEGF siRNA приняли участие одновременно две компании: препарат компании "Acuity Pharmaceuticals" - bevasiranib - воздействует непосредственно на мРНК фактора роста VEGF, в то время как препарат компании "siRNA Therapeutics" - Sirna-027 - взаимодействует с мРНК рецептора фактора роста VEGFR-1, что также приводит к торможению передачи сигнала и, соответственно, предотвращает формирование новых сосудов. В сентябре 2006 г. "Acuity Pharmaceuticals" объявила о положительных результатах II фазы клинических испытаний инъекций bevasiranib, который назначали 129 пациентам в 3 различных дозах. Более чем у трети больных достигнуто улучшение остроты зрения [35]. В настоящее время препарат проходит III стадию клинических испытаний [6].

Препарат Sirna-027 фирмы "siRNA Therapeutics" в ходе I фазы испытаний у 96% из 26 больных после однократной инъекции (от 100 до 1600 мкг) показал стабилизацию показателей остроты зрения, а у 23% пациентов спустя 8 нед после инъекции произошло клинически значимое улучшение [38]. Через 3 мес после однократной инъекции у 24 из 26 пациентов (92%) острота зрения стабилизировалась, у 4 из 26 пациентов (15%) наблюдали клинически значимое улучшение визуальной активности, у 2 из 26 пациентов (8%) уменьшилась визуальная активность. По данным оптической когерентной томографии, в большинстве случаев лечение привело к значимому уменьшению толщины центральной фовеолярной зоны.

Другой пример локальной доставки находится в области трансплантологии. Проблемы предотвращения отсроченной дисфункции трансплантатов, а также острого и хронического их отторжения до сих пор остаются ключевыми препятствиями на пути к увеличению времени выживания пересаженных органов. Наиболее значимым фактором, снижающим широкое использование донорских органов, являются ишемически-реперфузионные повреждения. Для улучшения характеристик трансплантанта, минимизации ишемически-реперфузионных повреждений, его реабилитации используют метод аппаратной перфузии. Использование перфузионных технологий также создает возможность фармакологической и аппаратной реабилитации поврежденного донорского органа в ишемическом периоде (от момента остановки сердца донора до момента пуска кровотока при пересадке). Так, сегодня активно изучается эффективность действия различных вариантов siРНК, посредством их добавок в консервирующий раствор при перфузии трансплантата с целью уменьшения повреждений, обусловленных ишемией-реперфузией [26]. К настоящему моменту существует целый ряд работ, направленных на использование siРНК для консервации различных пересаживаемых органов, в том числе печени [27, 31], почек [28, 34]. Более того, один из препаратов на основе siРНК (I5NP), предназначенный для предотвращения отсроченной функции трансплантата при пересадке почки, находится на I-II фазе клинических испытаний [36].

Примеры применения терапии на основе РНК-интерференции для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы

В настоящее время учеными активно ведутся исследования с целью использования siРНК для лечения практически всего спектра существующих заболеваний: офтальмологических, инфекционных, генетических, респираторных, метаболических, опухолевых и многих других [46]. В этом обзоре мы решили остановиться на заболеваниях сердечно- сосудистой системы.

Существуют 2 стратегии применения терапии, основанной на РНК-интерференции. Стратегия активации РНК-интерференции включает внедрение в клетку экзогенных siРНК для подавления экспрессии какого-либо целевого транскрипта или увеличение экспрессии существующей в клетке полезной микроРНК. И как было описано выше, данное воздействие может быть как кратковременным (невирусная доставка siRNA), так и долговременным (вариант вирусной доставки). Второй стратегией является направленное подавление процессов РНК-интерференции с использованием блокаторов конкретных эндогенных микроРНК клетки, так называемые антимикроРНК (antimiRNA), или антагомиры (antagomiR).

Хотя на сегодняшний день ни один препарат на основе РНК-интерференции не внедрен в клиническую практику, уже существует большое количество работ по применению данных препаратов на модельных животных. В случае кардиоваскулярной системы вышло много различных работ, посвященных исследованию влияния siРНК, микроРНК и антимикроРНК при трансплантации сердца, инфаркте миокарда, сердечной недостаточности, мерцательной аритмии, атеросклерозе, легочной гипертензии и др. (см. таблицу) [22 с изменениями].

Данные работы проводятся пока только на модельных животных и включают различные подходы к терапии. Ниже будут рассмотрены отдельные интересные примеры терапии на основе РНК-интерференции для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Как уже упоминалось выше, одним из перспективных и активно развивающихся направлений применения siРНК-терапии является трансплантация органов и клеток. С одной стороны, подавление экспрессии определенных генов обеспечивает лучшую сохранность и приживаемость органа, а с другой - изъятие органа создает оптимальные условия для применения генной терапии ex vivo, сводя к минимуму риск эктопической экспрессии препарата. Процесс ишемически-реперфузионного повреждения (ИРП) трансплантата лежит в основе первичной дисфункции и отсроченной функции пересаживаемого органа, поэтому основными мишенями siРНК-терапии при трансплантации органов являются гены, вовлеченные в ИРП. Несколько лет назад в опытах по пересадке сердца на мышах было показано, что перфузия трансплантата в течение 48 ч раствором, содержащим siРНК против мРНК генов TNF-α, C3 и Fas, приводит к значительному увеличению срока выживаемости трансплантата. При этом гистологические исследования пересаженных сердец выявили значительное снижение воспалительной инфильтрации и связанного с ней мультифокального массивного некроза миоцитов при обработке трансплантата siРНК по сравнению с контрольной группой [45].

Еще одной серьезной проблемой при трансплантации органов является отторжение трансплантата, вызванное активностью иммунной системы реципиента. Жанг и соавт. в опытах по аллотрансплантации сердца на мышах использовали векторы, экспрессирующие siРНК к рецепторам антигенпрезентирующих клеток CD40 и CD80.

Инъекция данных плазмид в хвостовую вену мышам-реципиентам до и после пересадки приводила к значительному увеличению срока выживаемости транспланата. Было показано, что 70% мышей, которые получали плазмиды, экспрессирующие siРНК, демонстрировали срок выживаемости трансплантата более 100 дней, тогда как в контрольной группе максимальный срок выживаемости трансплантата составлял 16 дней [44]. Таким образом, использование технологии РНК-интерференции при трансплантации органов является сравнительно новым и перспективным подходом, хотя и требует для своего развития большого количества разных исследований и клинических испытаний.

Другим направлением применения siРНК-терапии является подавление экспрессии мРНК генов, участвующих в развитии заболевания. Одним из таких генов является фосфоламбан (PLB); белок, кодируемый данным геном, ингибирует функцию Са-АТФазы SERCA, что в итоге приводит к усилению сократимости миокарда. Было показано, что при сердечной недостаточности снижается уровень SERCA или увеличивается активность PLB. Сукау и соавт. предложили использовать миРНК против мРНК гена PLB для терапии сердечной недостаточности [39]. В своей работе авторы используют специальную векторную систему на основе аденоассоциированного вируса для доставки шпилечного предшественника siРНК PLB (shRNA PLB) в клетки миокарда. У крыс была смоделирована сердечная недостаточность, а затем проведена инъекция данного вектора и оценены результаты через 1 и 3 мес. Как было показано, такая терапия восстанавливает систолические и диастолические функциональные показатели до нормальных значений и значительно снижает уровень гипертрофии сердца, диаметр кардиомиоцитов и уровень фиброза. Таким образом, авторы делают вывод, что данная терапия сердечной недостаточности высокоэффективна, более того, авторы указывают на отсутствие побочных эффектов со стороны печени.

Вторым подходом к терапии, основанной на РНК-интерференции, является увеличение экспрессии существующих в клетке полезных микроРНК. Для стабильного увеличения экспрессии микроРНК в клетках также используют векторы на основе вирусов, чаще всего аденоассоциированного вируса (AAV), хотя нередко используют и другие вирусные системы (например, лентивирусную). В работе Эулалио и соавт. инъекция AAV-вектора, экспрессирующего miR-590-3p и miR-199-3p, в периинфарктную зону взрослым мышам приводила к уменьшению зоны инфаркта примерно в 2 раза и увеличению пролиферации кардиомиоцитов в пограничной зоне инфаркта по сравнению с контрольной группой в 4 раза [24]. Кроме терапии последствий инфаркта миокарда увеличение экспрессии эндогенных микроРНК эффективно для предупреждения развития атеросклероза у мышей. Ловрен и соавт. на модельных животных показали, что введение вектора, экспрессирующего miR- 145 в гладкомышечных клетках сосудов, приводит к снижению размера образующихся атеросклеротических бляшек на 60% [30].

Следующим подходом к терапии, основанной на РНК-интерференции, является специфическое ингибирование эндогенных патогенных микроРНК через антимикроРНК. АнтимикроРНК представляют одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды длиной около 22 пн, содержащие ряд химических модифи- каций, увеличивающих их стабильность, сродство с микроРНК-мишенью и эффективность проникновения в клетки. Данные терапевтические агенты комплементарно связываются и стерически блокируют микроРНК-мишени. Использование антимикроРНК в генной терапии позволяет целенаправленно воздействовать на эндогенную микроРНК мишень и сводить к минимуму побочные эффекты, работая по схеме "одно лекарство-одна мишень".

На сегодняшний день проводятся многочисленные испытания антимикроРНК в терапии сердечно-сосудистых заболеваний. К примеру, miR-145 является самой распространенной микроРНК, экспрессирующейся в стенке артерий, она способна регулировать гладкомышечные клетки [3]. В опытах на мышах было показано, что использование антимикроРНК к miR-145 позволяет предотвратить развитие артериальной легочной гипертензии [2].

Ишемическое повреждение сердца в ряде случаев приводит к изменению уровня некоторых микроРНК и последующему ремоделированию кардиомиоцитов в поврежденной области. Так, при инфаркте миокарда увеличивается уровень miR-15. Использование антимикроРНК к miR-15 успешно снижает уровень микроРНК-15 в сердечной ткани мышей, а также уменьшает зону инфаркта и препятствует ремоделированию кардиомиоцитов в ответ на ишемическое повреждение [7].

Одной из причин сердечно-сосудистых заболеваний является высокий уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Одним из возможных путей снижения уровня ЛПНП является повышение уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). miR-33 является ключевым регулятором биогенеза ЛПВП, снижая его уровень в плазме. На зеленых мартышках было показано, что антимикроРНК к miR-33 приводит к значительному и продолжительному увеличению уровня ЛПВП [13].

Заключение

Ген-направленная терапия, основанная на механизме РНК-интерференции, включает 3 основных подхода: внедрение в клетку экзогенной siРНК для подавления экспрессии целевых генов, увеличение экспрессии существующей в клетке полезной микроРНК и применение блокаторов микроРНК с целью подавления экспрессии эндогенных патогенных микроРНК. Основной проблемой терапевтического применения малых РНК-молекул остается адресная доставка препарата. Однако в настоящее время ведется множество работ по преодолению данной проблемы. И хотя на сегодняшний день в клинической практике не применяется ни один препарат, действие которого основано на механизме РНК-интерференции, уже существует большое количество исследований, доказывающих эффективность данного вида терапии in vivo на модельных животных. Некоторые препараты уже находятся на разных стадиях клинических испытаний. Все это говорит в пользу того, что ген-направленная терапия, основанная на механизме РНК-интерференции, является перспективным направлением в разработке лекарственных препаратов для терапии большого количества различных заболеваний, в том числе заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Литература

1. Care A., Catalucci D., Felicetti F. et al. MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy // Nat. Med. - 2007. - Vol. 1, N 5. - P. 613-618.

2. Caruso P., Dempsie Y., Stevens H.C. et al. A role for miR-145 in pulmonary arterial hypertension: evidence from mouse models and patient samples // Circ. Res. - 2012. - Vol. 111, N 3. - P. 290-300.

3. Cheng Y., Liu X., Yang J. et al. MicroRNA-145, a novel smooth muscle cell phenotypic marker and modulator, controls vascular neointimal lesion formation // Circ. Res. - 2009. - Vol. 105, N 2. - P. 158-166.

4. Elmen J., Lindow M., Silahtaroglu A. et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA- antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver // Nucleic Acids Res. - 2008. - Vol. 36, N 4. - P. 1153-1162.

5. Fiedler J., Jazbutyte V., Kirchmaier B.C. et al. MicroRNA-24 regulates vascularity after myocardial infarction // Circulation. - 2011. - Vol. 124, N 6. - P. 720-730.

6. Garba A.O., Mousa S.A. Bevasiranib for the treatment of wet, age-related macular degeneration // Ophthalmol Eye Dis. - 2010. - Vol. 2. - P. 75-83.

7. Hullinger T.G., Montgomery R.L., Seto A.G. et al. Inhibition of miR-15 protects against cardiac ischemic injury // Circ. Res. - 2012. - Vol. 110, N 1. - P. 71-81.

8. Ji R., Cheng Y., Yue J. et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation // Circ. Res. - 2007. - Vol. 100, N 11. - P. 1579- 1588.

9. Lu Y., Zhang Y., Wang N. et al. MicroRNA-328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fibrillation // Circulation. - 2010. - Vol. 122, N 23. - P. 2378- 2387.

10. Merritt W.M., Bar-Eli M., Sood A.K. The dicey role of Dicer: implications for RNAi therapy // Cancer Res. - 2010. - Vol. 70, N 7. - P. 2571-1574.

11. Montgomery R.L., Hullinger T.G., Semus H.M. et al. Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac function and survival during heart failure // Circulation. - 2011. - Vol. 124, N 14. - P. 1537-1547.

12. Najafi-Shoushtari S.H., Kristo F., Li Y. et al. MicroRNA-33 and the SREBP host genes cooperate to control cholesterol homeostasis // Science. - 2010. - Vol. 328, N 5985. - P. 1566-1569.

13. Rayner K.J., Esau C.C., Hussain F.N. et al. Inhibition of miR-33a/b in non-human primates raises plasma HDL and lowers VLDL triglycerides // Nature. - 2011. - Vol. 478, N 7369. - P. 404-407.

14. Ren X.P., Wu J., Wang X. et al. MicroRNA-320 is involved in the regulation of cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting heat-shock protein 20 // Circulation. - 2009. - Vol. 119, N 17. - P. 2357-2366.

15. Thum T., Gross C., Fiedler J. et al. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling in fibroblasts // Nature. - 2008. - Vol. 456, N 7224. - P. 980-984.

16. Aigner A. Delivery systems for the direct application of siRNAs to induce RNA interference (RNAi) in vivo // J. Biomed. Biotechnol. - 2006. - Vol. 2006. - N 4. - P. 71659.

17. Akhtar S., Benter I. Toxicogenomics of non-viral drug delivery systems for RNAi: potential impact on siRNA- mediated gene silencing activity and specificity // Adv. Drug Deliv Rev. - 2007. - Vol. 59, N 2-3. - P. 164-182.

18. Amarzguioui M., Holen T., Babaie E., Prydz H. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA // Nucleic Acids Res. - 2003. - Vol. 31, N 2. - P. 589-595.

19. Bumcrot D., Manoharan M., Koteliansky V., Sah D.W. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs // Nat. Chem. Biol. - 2006. - Vol. 2, N 12. - P. 711-719.

20. Chiu Y.L., Rana T.M. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis // RNA. - 2003. - Vol. 9, N 9. - P. 1034-1048.

21. Chu Y., Yue X., Younger S.T. et al. Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter // Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38, N 21. - P. 7736-7748.

22. Condorelli G., Latronico M.V., Cavarretta E. microR- NAs in cardiovascular diseases: current knowledge and the road ahead // J. Am. Coll. Cardiol. - 2014. - Vol. 63, N 21. - P. 2177-2187.

23. Elmen J., Thonberg H., Ljungberg K. et al. Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33, N 1. - P. 439-447.

24. Eulalio A., Mano M., Dal Ferro M. et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration // Nature. - 2012. - Vol. 492, N 7429. - P. 376-381.

25. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. - 1998. - Vol. 391, N 6669. - P. 806-811.

26. Glebova K., Reznik O.N., Reznik A.O. et al. siRNA technology in kidney transplantation: current status and future potential // BioDrugs. - 2014. - Vol. 28, N 4. - P. 345-361.

27. Hernandez-Alejandro R., Zhang X., Croome K.P. et al. Reduction of liver ischemia reperfusion injury by silencing of TNF-alpha gene with shRNA // J. Surg. Res. - 2012. - Vol. 176, N 2. - P. 614-620.

28. Imamura R., Isaka Y., Sandoval R.M. et al. Intravital two-photon microscopy assessment of renal protection efficacy of siRNA for p53 in experimental rat kidney transplantation models // Cell Transplant. - 2010. - Vol. 19, N 12. - P. 1659-1670.

29. Kim E.J., Shim G., Kim K. et al. Hyaluronic acid complexed to biodegradable poly L-arginine for targeted delivery of siRNAs // J. Gene Med. - 2009. - Vol. 11, N 9. - P. 791-803.

30. Lovren F., Pan Y., Quan A. et al. MicroRNA-145 targeted therapy reduces atherosclerosis // Circulation. - 2012. - Vol. 126, N 11. - Suppl. 1. - P. S81-90.

31. Luo L., Lu J., Li W.C. et al. RNA interference targeting RelB attenuates liver ischemia/reperfusion injury // J. Surg. Res. - 2012. - Vol. 178, N 2. - P. 898-906.

32. Meister G., Landthaler M., Patkaniowska A. et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs // Mol. Cell. - 2004. - Vol. 15, N 2. - P. 185-197.

33. Miyagishi M., Hayashi M., Taira K. Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. - 2003. - Vol. 13, N 1. - P. 1-7.

34. Molitoris B.A., Dagher P.C., Sandoval R.M. et al. siRNA targeted to p53 attenuates ischemic and cisplatin-induced acute kidney injury // J. Am. Soc. Nephrol. - 2009. - Vol. 20, N 8. - P. 1754-1764.

35. Pharmaceuticals A. Acuity Pharmaceuticals Reports Positive Initial Phase II Results For Bevasiranib (Cand5) In Wet AMD - medicalnewstoday, 2006. URL: http://www.medicalnewstoday.com/releases/44387.php.

36. Pharmaceuticals Q. I5NP for Prophylaxis of Delayed Graft Function in Kidney Transplantation - clinicaltrials.gov, 2014. URL: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00802347.

37. Pillai R.S., Bhattacharyya S.N., Artus C.G. et al. Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells // Science. - 2005. - Vol. 309, N 5740. - P. 1573-1576.

38. Sirna Therapeutics I. Sirna Therapeutics Reports Final Results From Phase 1 Study On Its RNAi-Based Therapeutic For Age-Related Macular Degeneration - medical- newstoday, 2006. URL: http://www.medicalnewstoday.com/releases/49334.php.

39. Suckau L., Fechner H., Chemaly E. et al. Longterm cardiac-targeted RNA interference for the treatment of heart failure restores cardiac function and reduces pathological hypertrophy // Circulation. - 2009. - Vol. 119, N 9. - P. 1241-1252.

40. Ting A.H., Schuebel K.E., Herman J.G., Baylin S.B. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation // Nat. Genet. - 2005. - Vol. 37, N 8. - P. 906-910.

41. Wassenegger M. The role of the RNAi machinery in heterochromatin formation // Cell. - 2005. - Vol. 122, N 1. - P. 13-16.

42. Weinberg M.S., Villeneuve L.M., Ehsani A. et al. The antisense strand of small interfering RNAs directs histone methylation and transcriptional gene silencing in human cells // RNA. - 2006. - Vol. 12, N 2. - P. 256-262.

43. Zamecnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1978. - Vol. 75, N 1. - P. 280-284.

44. Zhang X., Liu Y., Zhang G. et al. Synergic silenc- ing of costimulatory molecules prevents cardiac allograft rejection // J. Transl. Med. - 2014. - Vol. 12. - P. 142.

45. Zheng X., Lian D., Wong A. et al. Novel small interfering RNA-containing solution protecting donor organs in heart transplantation // Circulation. - 2009. - Vol. 120, N 12. - P. 1099-1107.

46. Марахонов А.В., Баранова А.В., Скоблов М.Ю. РНК интерференция: фундаментальные и прикладные аспекты // Мед. генетика. - 2008. - No 10 (76). - C. 44-56.

47. Глебова К.В., Марахонов А.В., Баранова А.В., Скоблов М.Ю. Невирусные системы доставки siРНК // Молекул. биол. - 2012. - Т. 46. No 3. - C. 387-401.

48. Глебова К.В., Марахонов А.В., Баранова А.В., Скоблов М.Ю. Терапевтические siРНК и невирусные системы их доставки // Молекул. биол. - 2012. - Т. 46. No 3. - C. 371-386.

49. Скоблов М.Ю. Перспективы технологий антисмысловой терапии // Молекул. биол. - 2009. - Т. 43. No 6. - C. 1-15.