Изучение возможных биохимических и морфологических маркеров феномена "no-reflow" в эксперименте
Резюме
Цель работы - изучить взаимосвязь карбонильных производных протеинов и повреждение эндотелия сосудов как потенциальных предикторов развития феномена "no-reflow" в условиях
экспериментального моделирования реперфузии.
Методы. Исследование выполнено на лабораторных животных (крысах линии Wistar) в соответствии с этическими нормами, изложенными в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986) и приказе
Минздрава России No 267 от 19.06.2003 "Об утверждении правил лабораторной практики".
Модель реперфузии создавали путем пережатия брюшного отдела аорты с последующим кондиционированием. Определяли активность лизосомальных цистеиновых протеиназ, уровень
окислительно-модифицированных белков в плазме, в гомогенатах стенки сосудов и в интактной
стенке, выделенной дистальнее операционного вмешательства. Трансмиссионная электронная
микроскопия проведена на просвечивающем электронном микроскопе "Libra 120" с автоматическим сканированием изображений (Carl Zeiss, Германия). Статистический анализ результатов исследования проведен, согласно руководству по медицинской статистике с применением
современных методов виртуального математического анализа и использованием программы
"Statistica 10.0". Для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали критерий Манна-Уитни (U-тест).
Результаты. В ходе проведенного исследования доказано, что при экспериментальном моделировании реперфузии окислительный стресс развивается с 1-х по 7-е сутки в плазме и с 3-х
по 7-е сутки в сосудистой стенке. Окислительный стресс в сосудистой стенке характеризуется
истощением резервно-адаптационного потенциала и преобладанием вторичных маркеров на
фоне активации катепсинов В и L на 3-и и 5-е сутки, что нашло подтверждение в поражении
структур интимы.
Вывод. Достоверное увеличение вторичных метаболитов окислительного стресса в стенке сосуда вызвало повреждение эндотелиальных клеток, что может определять важное структурное
звено патогенеза феномена "no-reflow".
Ключевые слова:феномен "no-reflow", реперфузия, окислительный стресс, карбонильные производные протеинов, катепсины, эндотелий
Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2018. № 1. С. 62-69.
DOI: 10.24411/2308-1198-2018-00009
Статья поступила в редакцию: 16.08.2017. Принята в печать: 25.01.2018.
Несмотря на многолетнюю историю исследовательских работ в области реперфузионного повреждения тканей, на сегодняшний день патофизиология феномена "no-reflow" остается недостаточно изученной. Феномен "no-reflow"
не специфичен для артерий нижних конечностей.
В большей мере он описан при различных исследованиях головного мозга, почек, кожи, миокарда
[1-4]. Очевидно, что он имеет многофакторную
природу и не может быть описан с помощью какого-
либо одного механизма. Основной причиной феномена "no-reflow" становится повреждение сосудов
микроциркуляторного русла, носящее как структурный, так и функциональный характер [4-6].
Нарушения микроциркуляции могут быть обусловлены рядом патологических процессов: реперфузионным поражением клеток эндотелия,
приводящим к развитию стойкой эндотелиальной
дисфункции, отеком перикапиллярных тканей,
микроэмболизацией атероматозными и тромботическими массами, воспалительной реакцией в ответ на ишемию (развитие окислительного стресса,
активация свободнорадикального повреждения,
запуск каскада провоспалительных медиаторов,
локальная гиперкоагуляция), функциональными
нарушениями автономной (вегетативной) нервной
системы [7-9].
Многогранность патофизиологических процессов определяет важность проведения экспериментальных работ в изучении данного феномена
с возможностью сопоставления биохимических
и морфологических изменений [10].
Материал и методы
Исследование выполнено на 50 лабораторных животных (крысах линии Wistar массой
тела 250-300 г). Животных содержали в стандартных условиях вивария: они получали стандартный
рацион питания и воду ad libitum в соответствии
с этическими нормами, изложенными в Конвенции
по защите позвоночных животных, используемых
для экспериментальных и других научных целей
(Страсбург, 1986) и приказе Минздрава России
No 267 от 19.06.2003 "Об утверждении правил лабораторной практики".
Создание модели реперфузии путем
пережатия брюшного отдела аорты
с последующим кондиционированием
Все операции осуществляли под наркозом
с использованием препаратов "Ксило" 1 мг/кг
и "Золетил 50" 15 мг/кг. Из эксперимента животных выводили передозировкой золетила (Virbac
Sante Animale, Франция), внутримышечно, 50 мг/кг.
В качестве контроля изучали артериальную стенку
интактного животного.
Для проведения трансмиссионной электронной
микроскопии фрагменты сосудистой стенки, выделенные дистальнее места оперативного вмешательства, фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида
(Fluka, Швейцария) с постфиксацией в 1% растворе
OsO4 (Fluka, Швейцария). Контрастирование проводили 2,5% спиртовым раствором (70° этиловый
спирт) уранила ацетата (Fluka, Швейцария). Подготовленные кусочки заливали в смесь смол Эпона и Аралдита М (Fluka, Швейцария). Полутонкие
срезы окрашивали азуром II и эозином. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали
солями свинца и уранилацетатом по Рейнольдсу
(Уикли Б., 1975). Препараты изучали на транс-
миссионном электронном микроскопе "Libra 120"
с автоматическим сканированием изображений
(Carl Zeiss, Германия).
Для оценки окислительной модификации белков использовали определение уровня карбонильных производных по R.L. Levine в модификации
Е.Е. Дубининой [11]. Площадь под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков определяли по авторской методике, полученное значение выражали в условных
единицах/г белка. Активность лизосомальных
протеиназ и уровень окислительно-модифицированных белков определяли в гомогенатах стенки
сосудов и интактной стенке, выделенных дистальнее операционного вмешательства в 1-е, 3-и, 5-е,
7-е сутки [12]. Активность катепсинов В, L изучали
спектрофлуориметрическим методом по Barrett
& Kirschke [13]. Удельную активность катепсинов
в плазме выражали в нмоль амидометилкумарина/
с × г белка. Резервно-адаптационный потенциал
оценивали путем подсчета отношения площади
под кривой карбонильных производных белков
при спонтанном окислении протеинов к индуцированному по реакции Фентона. Для оценки доли
первичных маркеров подсчитывали сумму альдегид-динитрофенилгидразонов, для оценки вторичных - сумму кетон-динитрофенилгидразонов,
эти значения соотносили с общим содержанием
карбонильных производных белков (Sобщ).
Статистический анализ результатов исследо-
вания проводили согласно руководству по медицинской статистике с применением современных
методов виртуального математического анализа -
с использованием программы "Statistica 10.0".
Нормальность распределения данных проверяли
с помощью критерия Шапиро-Уилка (W-критерий).
Результаты представляли в формате Ме [min;
max], где Ме - медиана, min и max - минимальное
и максимальное значение. Для оценки статистической значимости различий независимых выборок
использовали ранговый критерий Манна-Уитни
(U-тест). Для проверки равенства медиан нескольких выборок использовали критерий Краскела-
Уоллиса. Для оценки ранговой корреляции использовали коэффициент Спирмена. Критический
уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Поскольку окислительный стресс является объединяющим признаком почти всех кардиоваскулярных патологий, а модификация белков - надежный
критерий его оценки, в качестве биомаркера, отражающего степень повреждения в условиях моделирования реперфузии целесообразно использовать
карбонильные производные протеинов.
Полученные значения площади под кривой
спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков свидетельствуют о развитии
окислительного стресса при моделировании реперфузии в 3-и, 5-е и 7-е сутки в сосудистой стенке
и с 1-х по 7-е сутки в плазме (рис. 1).
Рис. 1. Оценка окислительной модификации
белков сосудистой стенки (А) и плазмы (Б) при экспериментальном
моделировании
реперфузии * - статистически
значимые отличия от
контрольной группы.
Характерным признаком карбонильных производных окисленных белков является формирование СО-группы (альдегид- и кетогруппы): альдегидные производные окисленных белков принято считать ранними маркерами окислительного повреждения белка, а кетонные - поздними, характеризующими степень окислительной деструкции
белковой молекулы.
Для оценки степени повреждения белковых молекул анализировали долю первичных и вторичных
маркеров окислительного стресса. Из приведенных
результатов следует, что при экспериментальном
моделировании реперфузии в сосудистой стенке
преобладают вторичные маркеры на 3-и и на 5-е
сутки (табл. 1), а это в свою очередь свидетельствует об усугублении окислительного стресса и его
переходе в позднюю стадию.
Для оценки устойчивости белков к повреждающему воздействию используется реакция Фентона,
широко применяемая как источник гидроксильных
радикалов. Анализ спонтанной и металл-зависимой окислительной модификации белков позволяет оценить резервно-адаптационный потенциал,
косвенно характеризующий оборот белковых молекул. Полученные результаты демонстрируют, что
значение резервно-адаптационного потенциала снижается при экспериментальном моделировании
реперфузии на 3-и и 5-е сутки в сосудистой стенке,
а в плазме отмечается истощение резервно-адаптационного потенциала на 1-е, 3-и, 5-е сутки (рис. 2).
Рис. 2. Состояние
резервно-адаптационного
потенциала динитрофенилгидразонов (ДНФГ)
сосудистой стенки и плазмы при экспериментальной реперфузии
При экспериментальном моделировании реперфузии наблюдается увеличение активности катепсинов В и L плазмы с 3-х по 7-е сутки (табл. 2).
Активность катепсинов В и L сосудистой стенки при
ишемии-реперфузии нарастает в условиях окислительного стресса на 3-и, 5-е и 7-е сутки (см. табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют о том, что
развитие окислительного стресса при реперфузии,
а также активация свободнорадикальных процессов
плазмы и сосудистой стенки стимулируются напряжением кислорода, приводя к развитию окислительного
стресса на 3-и, 5-е, 7-е сутки в сочетании с накоплением вторичных маркеров окислительного стресса.
Исследование соотношения первичных (АДНФГ)
и вторичных (КДНФГ) маркеров окислительного
стресса дает возможность оценить стадию и потенциальную обратимость окислительного процесса.
Необратимое окисление белков, т.е. преобладание вторичных маркеров, свидетельствует об усугублении окислительного стресса, переходе его в позднюю стадию и приводит к утрате биологических
свойств протеинов, а в дальнейшем к их агрегации
или деградации, что наблюдается при моделировании реперфузии на 3-е и 5-е сутки в сосудистой
стенке.
Возможности антиоксидантной защиты кос-
венно можно оценить с помощью резервно-адаптационного потенциала. Нами обнаружено, что при
моделировании реперфузии на 3-и и на 5-е сутки
значение резервно-адаптационного потенциала
белков сосудистой стенки снижается, что может
свидетельствовать не только об истощении антиоксидантных систем, но и демонстрировать доступность белков к повреждающему действию.
Истощение резервно-адаптационного потенциала белков плазмы с 1-х по 5-е сутки при моделировании реперфузии демонстрирует накопление модифицированных протеинов, что может приводить
к формированию белковых агрегатов и затруднять
их деградацию протеолитическими системами.
В этих патологических условиях лизосомы играют
важную роль в жизнедеятельности клетки, так как
они способны индуцировать каспазо- и лизосомнозависимый апоптоз клетки.
Однако на фоне истощения резервно-адаптационного потенциала белков плазмы активация
лизосомальных цистеиновых протеиназ В и L дает
основание полагать, что модифицированные протеины разрушаются протеолитическими системами
с образованием пептидов и аминокислот, которые
могут быть направлены на синтез новых необходимых клетке протеинов.
Внутриклеточный уровень окисленных белков
отражает баланс между процессами формирования
карбонильных белков и степенью их деградации
протеолитическими системами. Возможно, в условиях окислительного стресса активность лизосомальных протеиназ возрастает вследствие того,
что модифицированные белки более чувствительны
к протеолизу. При экспериментальном моделировании реперфузии в условиях развивающего окислительного стресса в сосудистой стенке катепсины участвуют не только в деградации поврежденных
белковых молекул, но и, косвенно, в ремоделировании сосудов.
Статистически достоверное преобладание вторичных метаболитов в сосудистой стенке на 3-и
и 5-е сутки, свидетельствует об усугублении окислительного стресса и необратимости патологического процесса.
Морфологические изменения эндотелия
на 3-е сутки приобретают мозаичный характер.
Наряду с патологическими процессами происходят адаптационные изменения структур сосудистой стенки. В частности отмечено умеренное
расширение просвета некоторых сосудов, а также
изменения органелл эндотелиальных клеток: отек
отдельных митохондрий, увеличение площади поверхности ядер за счет образование инвагинаций,
умеренное усиление микропиноцитоза (рис. 3).
Вместе с компенсаторными изменениями обнаружены патологические нарушения эндотелиоцитов
кровеносных сосудов, которые характеризуются
отеком эндотелиальных клеток - их набуханием
и деструкцией отдельных митохондрий.
Митохондрии вакуолизированы, их матрикс
просветлен, кристы дезориентированы. Цистерны цитоплазматической сети и пластинчатого комплекса расширены. Превалируют данные, указывающие на реактивные изменения
эндотелиоцитов, которые заключаются в том числе
в увеличении ядерной поверхности за счет образования инвагинаций различной глубины и выраженной пиноцитозной активности плазмолеммы
эндотелиоцитов.
Параллельно в отдельных участках наблюдаются нарушения межэндотелиальных контактов
с расширением и отеком перикапиллярного пространства. При электронно-микроскопическом
исследовании ультраструктуры были обнаружены
изменения эндотелиальных клеток, базальной мембраны сосудов микроциркуляторного русла, перицитов и периваскулярного пространства.
Выявленное чередование "светлых" и "темных" эндотелиоцитов свидетельствует о том, что
клетки находятся либо в различных стадиях повреждения, либо в различных фазах функциональной активности; нельзя исключить, что первые находятся в стадии деструкции, а вторые выполняют
основную функцию эндотелиального слоя.
К 5-м и 7-м суткам в исследованном сосуде преобладают процессы ремоделирования кровеносных сосудов: деформирование и сужение просвета
микрососудов, разрыхление и нарушение целостности базальной мембраны, изменения перицитов,
склонность эритроцитов к адгезии и гемолизу.
Эти изменения свидетельствуют о нарушении
синхронности участия всего эндотелия в кровоснабжении тканей, повышении проницаемости сосудов и ведут к замедлению микрогемоциркуляции
и агрегации клеток крови.
Через 7 сут были выявлены генерализованные изменения: наблюдалось нарушение ультраструктуры всех слоев сосудистой стенки, эндотелиальные клетки находились в состоянии
тяжелой дистрофии, некроза, часть их выступала
в просвет сосудов в виде сосочков. Просвет сосуда был несколько сужен вследствие отека эндотелиоцитов.
Претерпевают изменения и митохондрии эндотелиальных клеток. Для них характерны отек, просветление матрикса, частичная или полная деструкция крист, вакуолизация.
Базальная мембрана имеет неравномерную толщину и среднюю электронную плотность. В структуре
базальной мембраны выявляли вакуолеподобные
образования, не ограниченные мембраной. Кроме
того, обнаруживали участки разрушения базальной
мембраны (рис. 4).
В области разрушения эндотелиального пласта
наблюдался контакт эритроцитов крови с коллагеновыми и эластическими волокнами, в этих участках констатировали пристеночный сладж эритроцитов, их агрегацию. Для этих участков отмечали
прилежание эритроцитов непосредственно к лейомиоцитам.
В непосредственной близи к участкам десквамации эндотелия, активировались внутриклеточные процессы в фибробластах. Их ядра приобретали фестончатый вид со множеством глубоких
и мелких инвагинаций ядерной мембраны. Ядерный хроматин частично конденсировался и концентрировался вблизи ядерной мембраны. В центральной области матрикса появлялись скопления
рибосом. Перинуклеарные пространства расширены не были.
Таким образом, при исследовании ультраструктуры сосудистой стенки в группе ишемия-реперфузия были обнаружены адаптивные и патологические изменения в эндотелиальных клетках.
Полученнные данные свидетельствуют о значительном нарушении микрогемодинамики в тканях
при реперфузии.
В настоящее время одним из наиболее важных
подходов к лечению облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей служит стратегия своевременной реваскуляризации. Однако
существуют патофизиологические механизмы,
способные свести к минимуму эффект реваскуляризации даже при ее успешности. В частности,
к таким механизмам относится феномен "no-
reflow". Сегодня этой проблеме уделяют мало
внимания. В связи с активным внедрением новых
высокотехнологичных методов и возможностей количество реваскуляризаций конечностей во многих
регионах России увеличивается, а следовательно,
увеличиваются частота феномена "no-reflow"
и его актуальность для отечественного здравоохранения [14], что обусловливает необходимость
понимания его клинического значения, основных
механизмов возникновения, методов профилактики и лечения. Кроме того, отсутствие однозначных принципов предотвращения этого состояния
свидетельствует о необходимости крупных проспективных рандомизированных исследований,
посвященных изучению феномена "no-reflow".
В ходе проведенного исследования было доказано, что при экспериментальном моделировании реперфузии окислительный стресс развивается
с 1-х по 7-е сутки в плазме и с 3-х по 7-е сутки
в сосудистой стенке. Окислительный стресс в сосудистой стенке характеризуется истощением
резервно-адаптационного потенциала и преобладанием вторичных маркеров на фоне активации
катепсинов В и L на 3-и и 5-е сутки, что нашло подтверждение в поражении структур интимы и может
определять важное структурное звено патогенеза
феномена "no-reflow".
Литература
1. Коваль М. Феномен "no-reflow" - ложка дегтя в бочке
меда реваскуляризации // Med. Review. 2008. No 5 (05). С. 32-36.
2. Van de Werf F., Bax J., Betriu A. et al. Management of acute myocardial infarction in patients presenting with persistent
ST-segment elevation: The Task Force on the management of ST-
segment elevation acute myocardial infarction of the European
Society of Cardiology // Eur. Heart J. 2008. Vol. 29. P. 2909-
2945.
3. Ito H. No-reflow phenomenon and prognosis in patients
with acute myocardial infarction // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med.
2006. Vol. 3. P. 499-506.
4. Fischell T.A. Pharmaceutical interventions for the management of no-reflow // J. Invasive Cardiol. 2008. Vol. 20, N 7. P. 374-
379.
5. Lee K.W., Norell M.S. Management of "no-reflow"
complicating reperfusion therapy // Acute Card. Care. 2008. Vol. 10,
N 1. P. 5-14.
6. Valero S.J., Moreno R., Reyes R.M., et al. Pharmacological
approach of no-reflow phenomenon related with percutaneous
coronary interventions // Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem.
2008. Vol. 6, N 2. P. 125-129.
7. Лущак В.И. Свободно-радикальное окисление белков и
его связь с функциональным состоянием организма // Биохимия.
2007. Т. 72, вып. 8. С. 995-1017.
8. Vasil’ev Y.V. et al. Protein modifications by electrophilic
lipoxidation products: adduct formation, chemical strategies and
tandem mass spectrometry for their detection and identification //
Mass Spectrom. Rev. 2013. Vol. 33, N 3. P. 157-182.
9. Hristova M., Penev M. Oxidative stress and cardiovascular
diseases // Vasc. Pharmacol. 2012. Vol. 12, N 3. P. 296-303.
10. Абаленихина Ю.В., Фомина М.А., Исаков С.А.. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсина
L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза
оксида азота // Рос. мед.-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова.
2013. No 1. С. 44-48.
11. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А. и др. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека,
метод ее определения // Вопр. мед. химии. 1995. Т. 41, No 1.
С. 24-26.
12. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В. Способ комплексной
оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях. Патент на изобретение
РФ No 2524667. Бюл. 27.07.2014.
13. Barrett A.J. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L //
Methods Enzymol. 1981. Vol. 80. P. 535-561.
14. Калинин Р.Е., Пшенников А.С., Сучков И.А. Реперфузионное повреждение тканей в хирургии артерий нижних конечностей // Новости хир. 2015. Т. 23, No 3. С. 348-352.