По разным оценкам, распространенность этого вида кардиомиопатии в Европе варьирует от 1:2000 до 1:5000 населения [1, 3]. В российских медицинских изданиях опубликованы серии наблюдений за пациентами с АКПЖ и описаны отдельные клинические случаи [4-6]. Однако масштабных эпидемиологических исследований не проводилось, поэтому частота встречаемости АКПЖ в России достоверно неизвестна.
АКПЖ в большинстве случаев наследуется по аутосомно-доминантному типу. Аутосомно-рецессивные формы встречаются значительно реже [7, 8]. Заболевание чаще диагностируют у мужчин (1,6:1), хотя ни одной формы АКПЖ, сцепленной с полом, до сих пор неизвестно. Естественное течение заболевания, возраст манифестации, риск ВСС также не зависят от пола [9]. Более чем в 50% случаев АКПЖ - это семейное заболевание с неполной пенетрантностью и вариабельностью клинических проявлений даже среди членов одной семьи [10].
Впервые критерии постановки диагноза "аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка" были предложены в 1994 г. группой исследователей под руководством McKenna [11].Однако в самостоятельный тип кардиомиопатий заболевание было выделено в 2006 г. в классификации Американской сердечной ассоциации (АНА) [12]. В настоящее время для постановки диагноза используют модифицированные критерии 2010 г. [13]. К диагностическим критериям относят 6 групп признаков: глобальная/региональная дисфункция и структурные изменения миокарда, гистологические изменения, нарушения реполяризации, нарушения деполяризации/проводимости, аритмии, семейный анамнез. В каждой группе предусмотрено деление на большие и малые критерии. На сегодняшний день выявление мутаций в генах, ответственных за АКПЖ, рассматривается как большой диагностический критерий заболевания. Диагноз АКПЖ считается достоверным при наличии 2 больших критериев, либо 1 большого и 2 малых критериев, либо 4 малых критериев из разных категорий. Диагноз АКПЖ является вероятным при наличии 1 большого и 1 малого либо 3 малых критериев из различных категорий. Диагноз АКПЖ является возможным при наличии 1 большого либо 2 малых критериев из разных категорий [13].
АКПЖ - генетически гетерогенное заболевание. В настоящее время идентифицированы 14 локусов, в которых картированы 12 генов, от- ветственные за АКПЖ (табл. 1). Наиболее частой причиной заболевания являются мутации в генах десмосом: плакофилине (PKP2), десмоглеине (DSG2), десмоплакине (DSP), плакоглобине (JUP) и десмоколлине (DSC2). Были идентифицированы мутации и в других генах: гене трансформирующего фактора роста бета-3 (TGFB3), генах десмина (DES), ламина (LMNA) и титина (TTN) и т.д. Однако этот список не исчерпывает генетического разнообразия АКПЖ.
В 25-40% случаев АКПЖ обусловлена мутациями в гене плакофилина (PKP2), в 12-40% случаев - мутациями в гене десмоглеина (DSG2) [14].
Ведущую роль в патогенезе играет нарушение нормального функционирования десмосом - белковых структур, выполняющих функцию механического связывания кардиомиоцитов между собой. Изменения в десмосомных белках приводят к нарушению клеточной адгезии на границе вставочных дисков и, следовательно, к уменьшению способности кардиомиоцитов противостоять механическим нагрузкам во время сердечного цикла.
Снижение толерантности к механическому стрессу может вести к апоптозу и фиброзно-жировой инфильтрации миокарда. Экспериментальные данные также указывают, что нарушение функции десмосом ведет к прогрессирующему ремоделированию вставочных дисков [15]. Замещение фиброзной и/или жировой тканью кардиомиоцитов правого желудочка является субстратом для возникновения желудочковых тахиаритмий.
Цель исследования - оценка представленности мутаций, выявленных в генах PKP2 иDSG2 у пациентов с АКПЖ, и вклада результатов генетического обследования в диагностику заболевания.
Материал и методы
В ФГБУ РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН были обследованы 40 больных с диагнозом АКПЖ, поставленным с различной степенью вероятности, которые обратились за медико-генетическим консультированием и ДНК-диагностикой. Для пилотного исследования было отобрано 20 больных с наибольшим числом выполненных диагностических критериев [13].
Все пациенты дали информированное согласие на проведение генетического исследования. Средний возраст на момент обращения составил 40 лет. Контрольную группу составили образцы ДНК 100 здоровых добровольцев.
Клиническое и лабораторное обследование включало сбор семейного анамнеза, общий и биохимический анализ крови, ЭКГ, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, Эхо-КГ, рентгенографию органов грудной клетки, биопсию миокарда, МРТ сердца (по показаниям).
Генетическое обследование включало выделение ДНК из цельной крови стандартным методом, прямое секвенирование по Сенгеру кодирующих и прилежащих интронных последовательностей генов PKP2 и DSG2, анализ результатов секвенирования, оценку частот встречаемости выявленных генетических вариантов в группе здоровых добровольцев, биоинформатический анализ эффекта мутаций.
По запросу одной семьи была проведена ранняя ДНК-диагностика в возрасте 10 мес сыну пробанда с выявленной мутацией в гене PKP2 для подтверждения или исключения диагноза АКПЖ.
Результаты и обсуждение
В настоящее время результаты генетических исследований все шире используются в кардиологической практике для уточнения диагноза АКПЖ. Развитие методов молекулярной генетики, накопление данных о генетической природе заболевания позволили повысить чувствительность диагностики АКПЖ. На сегодняшний день наличие мутаций в генах, ответственных за развитие заболевания, рассматривается как большой диагностический критерий [13].
Отсутствие ДНК-диагностики этого типа кардиомиопатии в России практически лишало российских врачей возможности использовать один из больших диагностических критериев.
В лаборатории медицинской генетики ФГБУ РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН впервые в России была разработана и внедрена в практику ДНК-диагностика основных генетических форм АКПЖ. Проводится поиск мутаций методом прямого секвенирования по Сенгеру кодирующих и прилежащих интронных областей большинства известных генов, ответственных за АКПЖ (табл. 1).
В нашем исследовании поиск мутаций в генах PKP2 и DSG2 был выполнен 20 пациентам с направляющим диагнозом АКПЖ. Эти гены были выбраны для пилотного исследования, так как мутации в них являются наиболее частой причиной АКПЖ в обследованных популяциях. В 25-40% случаев АКПЖ обусловлена мутациями в гене плакофилина (PKP2), в 12-40% случаев - мутациями в гене десмоглеина (DSG2) [14].
В гене PKP2 у 3 пациентов были выявлены мутации: р.W538X, с.1523_1538del, p.S140F. В генеDSG2 у 4 пациентов были выявлены миссенс-мутации: p.S194L, p.V533I, p.R49H и p.N245H. Таким образом, мутации в 2 генах, ответственных за самые частые формы АКПЖ в Европе, были выявлены у 7 пробандов из 20, что составило 35% обследованной группы больных (15% мутаций выявлено в гене PKP2, 20% - в гене DSG2). Полученные на российской выборке больных результаты согласуются с данными о представленности этих генетических форм в Европе [14].
Большинство выявляемых в генах десмосом патогенных мутаций - это инсерции, делеции, нонсенс-мутации, приводящие к синтезу укороченного белка или недостаточному синтезу белка дикого типа (гаплонедостаточность). Такие мутации значимо нарушают функцию белка, и их патогенетическое значение, как правило, не вызывает сомнений. Миссенс-мутации, т.е. приводящие к замене одной аминокислоты на другую в полипептидной цепи, составляют до 20% всех выявляемых мутаций в генеPKP2 и до 60% - в гене DSG2 [16]. Корректная оценка роли таких мутаций в развитии заболевания, как правило, очень сложна, особенно если генетическое изменение было обнаружено впервые. Гены, ответственные за АКПЖ, высоко полиморфны и содержат большое количество несинонимичных замен, часто встречающихся и у здоровых лиц [17], поэтому для интерпретации каждой находки привлекаются популяционные, биоинформатические и, по возможности, экспериментальные данные. Патогенетическая значимость всех выявленных миссенс-вариантов в генах PKP2 иDSG2 оценивалась нами с помощью биоинформатических ресурсов PolyPhen2 и SIFT [18, 19]. Результаты биоинформатического анализа представлены в табл. 2.
Мы оценили количество диагностических критериев до и после проведения ДНК-диагностики у пациентов с найденными мутациями. Выявленные мутации и имевшиеся комбинации диагностических критериев представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, выявление мутации, характерной для АКПЖ, у 3 из 7 пробандов позволило увеличить достоверность диагноза. Даже при достоверном клиническом диагнозе проведение ДНК-диагностики необходимо для окончательного подтверждения диагноза наследственного заболевания, так как оно является "золотым стандартом" обследования и позволяет перейти к обследованию членов семьи.
В конце 2011 г. было опубликовано первое международное руководство, посвященное генетическому тестированию больных с сердечными каналопатиями и кардиомиопатиями [20]. В нем представлено мнение экспертов, в каких случаях ДНК-диагностика показана больным и их родственникам.
Применительно к пациентам с АКПЖ представлены следующие рекомендации:
1. Рекомендуется проведение генетического тестирования родственникам пациента с выявленной мутацией.
2. Поиск мутаций в генах PKP2, DSG2, DSP, JUP, DSC2 и TMEM43 может быть полезен для пациентов с диагнозом АКПЖ, поставленным на основе диагностических критериев 2010 г.
3. Генетическое тестирование может быть предложено пациентам с возможным диагнозом АКПЖ (1 большой или 2 малых критерия) в соответствии с диагностическими критериями 2010 г.
4. Генетическое тестирование не показано для пациентов с единственным малым критерием в соответствии с диагностическими критериями 2010 г.
Во всех семьях, где была выявлена генетическая причина заболевания, появилась возможность провести ДНК-диагностику АКПЖ у родственников (включая раннюю и пресимптоматическую). Учитывая возможность длительного бессимптомного течения заболевания и высокий риск внезапной смерти, выявление носителей мутации позволит проводить эффективную первичную профилактику ВСС. Она включает ограничение средовых факторов риска нарушений ритма сердца и прогрессирования сердечной недостаточности (физической и эмоциональной нагрузки, миокардита), своевременное начало медикаментозной терапии или хирургическое лечение АКПЖ. Пресимптоматическая ДНК-диагностика среди членов семьи пробанда выполняется каскадным способом: в первую очередь тестируются родственники первой степени родства (родители и дети), затем - ближайшие родственники облигатных носителей, братья и сестры. Дальнейшему тестированию подлежат только родственники носителей мутации.
Согласно руководству по генетическому обследованию больных с первичными каналопатиями и кардиомиопатиями, родственники первой степени родства, даже не имеющие клинических признаков заболевания, нуждаются в ежегодном детальном кардиологическом обследовании [20]. При этом продолжительность такого динамического наблюдения нигде не оговаривается, оно по умолчанию становится пожизненным. Поэтому для родственников очень важны не только положительные, но и отрицательные результаты ДНК-диагностики, которые позволяют избежать затратного многолетнего мониторинга без клинической необходимости.
Одним из таких примеров была выполненная ранняя ДНК-диагностика АКПЖ по запросу семьи для ребенка 10 мес, сына пациента с выявленной делецией с.1523_1538del в гене PKP2 [21]. Нам удалось исключить носительство делеции у ребенка. Важно отметить, что снятие диагноза наследственного заболевания с серьезным прогнозом имело важное психологическое значение для членов семьи и избавило их от тревоги, связанной с неопределенностью в отношении здоровья ребенка.
До настоящего времени стратегия лечения и стратификация риска больных с АКПЖ проводятся на основе результатов ретроспективного анализа, полученного в единичных диагностических центрах и включающего относительно небольшие группы больных [16]. Поэтому данных для корректной оценки прогностического значения конкретных мутаций на сегодняшний день недостаточно.
Однако накоплены описания больных с несколькими мутациями в генах десмосом: наличие 2 мутаций в одном гене (компаунд-гетерозиготы), мутации в более чем одном гене (дигенное и поли- генное наследование). В 2009 г. Bhuiyan и соавт. описали дигенные формы АКПЖ, вызванные мутациями в генах DSC2 и DSG2 [22]. Дальнейшие исследования подтвердили, что множественные мутации в генах десмосом ассоциированы с быстропрогрессирующей клинической картиной АКПЖ и риском ВСС по сравнению с носителями 1 мутации [23, 24]. Таким образом, выявление 2 мутаций в заинтересованных генах может рассматриваться как независимый генетический фактор риска ВСС.
В последнее десятилетие достижения в генетике позволили быстро и эффективно секвенировать геном человека и получать данные, затрачивая меньше времени и средств. Технология секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS) позволяет одномоментно анализировать большое количество генов, идентифицировать мутации в новых генах-кандидатах, что находит все большее применение в клинической практике. С помощью технологии NGS в семье с АКПЖ идентифицировали первую мутацию в гене десмина (DES), который не входил ранее в список генов, ассоциированных с заболеванием [25].
Заключение
Впервые в России в клиническую практику было внедрено генетическое обследование боль- ных с АКПЖ. Частоты мутаций, обнаруженных в генах PKP2 и DSG2 в нашей выборке больных, согласуются с частотами мутаций этих генов в европейских выборках.
Положительные результаты ДНК-диагностики (выявленные мутации) имеют важное значение для верификации заболевания у пробанда и повышают достоверность диагноза. Особенно большое значение выявление мутаций (или исключение их носительства) имеет для кровных родственников пробанда, в том числе на доклинических стадиях развития заболевания.