Рис. 5. Гистологические изменения на 6-е сутки после операции (свинья 3, первый этап эксперимента): А - умеренный отек, неоангиогенез и пролиферативная активность в среднем слое стенки кишки (окраска гематоксилином и эозином, х100); Б - резко выраженная положительная активность SMA в мышечном слое (иммуногистохимическая реакция, х200)
Fig. 5. Histological findings on day 6 after spring placement (pig 3, 1st stage of the experiment): А - mild enema, neoangiogenesis and proliferative activity in the middle layer of intestinal wall (HE, х100); В - distinct positive SMA activity in the muscle layer (IHC, х200)
На втором этапе эксперимента были выявлены различия гистологической картины стенки тонкой кишки в исследуемых сегментах на 10, 20 и 30-е сутки после операции.
На 10-е сутки отмечали незначительную грануло- и лимфоцитарную инфильтрацию слизистой оболочки, очаговые кровоизлияния. В подслизистом слое наблюдали отек, резко выраженное полнокровие и неоангиогенез, повышенную пролиферативную активность за счет гладкомышечных клеток и фибробластов, в целом преобладала нежная соединительная ткань. Толщина мышечного слоя была практически равна контрольным значениям (187,96±22,8 мкм), однако регулярность волокон была нарушена. В области висцеральной брюшины - полнокровие и активный неоангиогенез.
На 20-е сутки после операции в слизистой оболочке признаки острого воспаления не определялись. Обращало внимание увеличение количества бокаловидных клеток. В подслизистом слое обнаруживали активные пролиферативные изменения и неоангиогенез (рис. 6). В мышечном слое наблюдали неравномерное прокрашивание мышечных волокон и существенную гипертрофию (302,52±24,78 мкм). В висцеральной брюшине сохранялся неоангиогенез.
Рис. 6. Пролиферативные изменения и неоангиогенез в подслизистой оболочке опытного сегмента на 20-е сутки после операции. Окраска по Маллори, ×40
Fig. 6. Proliferative changes and neoangiogenesis in submucosal layer of intestinal segment of day 20 after surgery (Mallory staining, ×40)
На 30-е сутки после операции в слизистой оболочке сохранялось значительное количество бокаловидных клеток (рис. 7, А), усиливались гладкомышечные и стромальные компоненты ворсин (рис. 7, Б). Мышечные слои примерно той же толщины, что и на 20-е сутки (312,77±12,15 мкм), т.е. более чем в 1,5 раза толще контрольных. Сохранялась неравномерная окраска мышечных волокон. Согласно уровню экспрессии CD34, активность неоангиогенеза во всех слоях умеренная.
Рис. 7. Гистологические изменения на 30-е сутки после операции: А (слева) - значительное количество бокаловидных клеток в слизистой оболочке (окраска по методу Романовского, х200); Б (справа) - утолщение гладкомышечных компонентов ворсин (ИГХ реакция на гладкомышечный актин, х200)
Fig. 7. Histological findings on day 30 after surgery: А (left) - a significant number of goblet cells in the mucous membrane (Romanovsky staining, х200); В (right) - thickening of the smooth muscle components of the villi (IHC for smooth muscle actin, х200)
Механические испытания стенки кишечника. Оценка степени удлинения кишечника и допустимой жесткости пружины
На рис. 8 показаны кривые деформирования для образцов кишечника. На исходных кривых деформирования в осях "сила-перемещение" (рис. 8, А) наблюдали области локализации пиковвозрастания-снижения нагрузки (вызванные небольшим проскальзыванием образцов в захватах) с общим положительным трендом. Стрелками показаны области, соответствующие началу разрыва образцов. Напряжение, соответствующее минимальному из этих значений, - σP = 0,3 МПа. Видно, что материал стенки свиного кишечника показывает ярко выраженное нелинейное поведение на широком диапазоне деформаций. Участки кривых, лежащие правее точки начала разрыва, интереса не представляют. Для оценки степени удлинения и допустимой жесткости аппроксимировали исходные кривые в диапазоне деформаций от 0 до 300% полиномиальными зависимостями по методу наименьших квадратов. Получили зависимости, показанные на рис. 8, Б. В эксперименте наблюдали выраженные области натяжения тканей в местах контакта с торцевыми витками, что говорит о концентрации напряжений, которая зависит от многих факторов: от геометрии пружины, пликирования, механических свойств ткани. Из-за вероятности импульсного воздействия резко раскрывшейся пружины на стенку кишечника, приводящего к дополнительным напряжениям и высокому риску разрыва ткани, целесообразно снизить расчетное значение σP= 0,3 МПа в 3-5 раз. Используя полученную величину допускаемого напряжения [σP] = 0,06 МПа, величину диаметра пружины 13 мм, толщину стенки кишечника 0,5 мм и величину первоначального сжатия пружины 50 мм, определили верхнюю границу допустимой жесткости пружины [к] ≤ 32 Н/м. На первом этапе эксперимента использовали пружину жесткостью 27,8 Н/м, наблюдали выраженное натяжение в местах контакта краевых витков и стенок кишечника без перфораций. Таким образом, значение жесткости 27,8 Н/м близко к критическому, при превышении которого возможны негативные последствия.
Рис. 8. Кривые деформирования образцов свиного кишечника шириной 20 мм (красная кривая) и 16 мм (черная кривая): А - слева; Б - справа
Fig. 8. Deformation curves of specimens of porcine intestines with a width of 20 mm (red curve) and 16 mm (black curve): А - left; В - right
Используя энергетический критерий, оценили степень удлинения стенки кишечника с использованием экспериментальных данных. Полагали k=27,8 Н/м, Δl=50 мм, D=13 мм, t=0,5 мм, l0=25 мм. Использовали зависимость σ=σ(ε), для которой определили напряжение начала разрыва. Решали полученное уравнение относительно параметра удлинения lÊ численно и получили значение - 22,9 мм. Тогда суммарное изменение длины определили как L=l0 + lÊ=47,9 мм. Экспериментальное значение составило около 45 мм. Погрешность по данным расчета составила 6,4%. Следует отметить, что для получения более точной аналитической модели и привлечения компьютерного моделирования (для более точного моделирования процесса дистракционного энтерогенеза, оценки напряжений в областях контакта торцевых витков и стенок кишечника) необходимо больше экспериментальных данных, так как вариабельность механических свойств кишечника очень высока.
Обсуждение
В результате проведенных экспериментов нам удалось выяснить, что использование биодеградируемых пружин из поли-ε-капролактона действительно приводит к удлинению сегментов кишечника не за счет эластичности кишечной стенки, а за счет активной пролиферации ее слоев. Одновременная имплантация нескольких пружин позволяет добиться большей суммарной длины тонкой кишки. Среди выживших животных ни сами пружины, ни фиксирующие плики не создавали проблем для пассажа и не вызывали явлений кишечной непроходимости. Все животные продолжали набирать массу и усваивать энтеральную нагрузку, начиная с жидкой диеты сбалансированными смесями с постепенным добавлением густого компонента (каш) и последующим переходом на комбикорм. Гистологический анализ показал общую динамику изменений, наблюдаемую в процессе дистракционного энтерогенеза на разных сроках после имплантации пружин. Начальные этапы дистракции характеризовались развитием умеренного острого воспаления в слизистой оболочке, подслизистом и мышечном слоях, при этом одновременно начиналась их активная пролиферация, ремоделирование мышечных волокон, запускался неоангиогенез. На более поздних сроках явления воспаления стихали, превалировали процессы пролиферации слоев, увеличивалось количество бокаловидных клеток, утолщались ворсины, происходила гипертрофия мышечной оболочки, усиливался неоангиогенез. Выраженных различий в гистологической картине между средне- (20 сут) и долгосрочным (30 сут) послеоперационным наблюдением не было.
Ранние хирургические осложнения на первом этапе эксперимента, приведшие к гибели 2 особей, были обусловлены высокой травматизацией кишечной стенки во время фиксации пружин. При отсутствии желатиновых капсул, сохраняющих пружину в сжатом виде и позволяющих проводить манипуляции без риска их расправления, приходилось сжимать пружины вручную через кишечную стенку, что создавало избыточное натяжение при формировании фиксирующих плик. Впоследствии это привело к перфорациям и перитониту.
Фиксация пружин - это один из самых важных этапов имплантации. При недостаточном зауживании просвета кишечника пружины могут частично или полностью мигрировать из места их установки, что наблюдалось в нескольких случаях в данной работе. При зауживании просвета кишки необходимо обеспечить надежную фиксацию пружины с двух сторон, при этом не создавая предпосылок к кишечной непроходимости. В работе G. Dubrovsky и соавт., описывающей различные варианты фиксации пружин, утверждается, что зауживание просвета кишечника менее чем на 50% исходного диаметра приводит к преждевременному расправлению пружины, ее частичной или полной миграции, а также способствует лишь минимальному удлинению сегмента тонкой кишки [29].
Выбор жесткости пружины не менее важен. Согласно данным J.D. Rouch и соавт., механические параметры пружины выбирают с учетом площади поперечного сечения кишки, массы объекта, а также длины расправления пружины; они могут быть экстраполированы на объекты разного калибра [25]. Мы выбрали ряд жесткостей от 8 до 27 Н/м, чтобы определить оптимальное, безопасное и эффективное значение, которое приводит к достаточному удлинению и не вызывает осложнений.
Несмотря на то что использование пружины максимальной жесткости не привело к перфорации, в месте ее имплантации отмечалось выраженное натяжение кишечной стенки. В то же время при использовании более мягких пружин натяжение было менее выражено, а конечная степень удлинения - идентичной. Пружины с наименьшей жесткостью привели к менее выраженному удлинению (в среднем от 1,5 до 2 раз от исходной длины сегмента) и не во всех случаях расправились до исходного состояния, потеряв свое стимулирующее воздействие на пролиферативную активность кишечной стенки.
Таким образом, по нашему мнению, для данной экспериментальной модели оптимальная жесткость ~15 Н/м. Тем не менее в клинической практике наблюдается высокая вариабельность механических свойств кишечной стенки пациентов, особенно у детей разных возрастов с различной пострезекционной анатомией, выраженностью воспаления, толщиной кишки. Это требует более персонифицированного подбора механических свойств удлиняющего устройства.
H.S. Hosseini и соавт. разработали компьютерную модель, с помощью которой можно достаточно точно рассчитать необходимые параметры удлиняющего устройства, ссылаясь на те же самые показатели (площадь поперечного сечения и масса), дополнительно учитывая толщину кишечной стенки [30]. При внедрении дистракционного энтерогенеза в клиническую практику выбор пружин с оптимальными механических параметрами можно будет делать интраоперационно из нескольких вариантов, с учетом особенностей и макроскопического состояния кишечника конкретного пациента.
Еще одна проблема данного исследования - неинформативность радиологического мониторинга, что не позволило наблюдать за эффективностью и последовательностью процесса дистракции. До сих пор открыт вопрос технологии контрастного усиления пружины из поли-ε-капролактона для ее более четкой визуализации на разных сроках после имплантации. Данная проблема отсутствует при использовании нитиноловых пружин [29].
Экстракция пружин по окончании дистракции также является предметом дискуссии. Использование биодеградируемых пружин не требует их специального извлечения, так как впоследствии они фрагментируются и подвергаются резорбции. В то же время формирование фиксирующих плик с помощью рассасывающегося шовного материала способствует последующей самостоятельной экстракции пружин с естественным пассажем по кишечнику, что позволяет применять устройства не из биоразлагаемых материалов.
До сих пор большинство экспериментальных работ с дистракционным энтерогенезом проводились на моделях здоровых животных без СКК. Моделирование СКК с целью тестирования устройств для механического удлинения может открыть новые нюансы на пути внедрения этой концепции в клиническую практику.
Заключение
Описанные пилотные эксперименты позволяют говорить об эффективности концепции дистракционного энтерогенеза, что соответствует зарубежным данным. Описанное устройство и методика имплантации максимально приближены к возможному использованию в клинической практике. Тем не менее требуется проведение дополнительных, более систематических экспериментов с большей выборкой и полноценными статистическими группами для более точного расчета механических параметров пружин с учетом индивидуальных особенностей объекта, а также более детального изучения изменений, происходящих в стенке кишечника на разных сроках дистракции.
Благодарности
Авторы выражают благодарность И.Х. Исмагилову и Л.А. Фомину за финансовую помощь в проведении исследования, С.В. Крашенинникову - за проведение испытаний механических характеристик стенки кишечника.
Литература
1. Neumann C.G. The expansion of an area of skin by progressive distention of a subcutaneous balloon: use of the method for securing skin for subtotal reconstruction of the ear // Plast. Reconstr. Surg. 1957. Vol. 19. P. 124-130.
2. Ilizarov G.A. Clinical application of the tension-stress effect for limb lengthening // Clin. Orthop. 1990. Vol. 250. P. 8-26.
3. Pironi L. Definitions of intestinal failure and the short bowel syndrome // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2016. Vol. 30, N 2. P. 173-185.
4. Thompson J.S., Rochling F.A., Weseman R.A. et al. Current management of short bowel syndrome // Curr. Probl. Surg. 2012. Vol. 49, N 2. P. 52-115. DOI: https://doi.org/10.1067/j.cpsurg.2011.10.002.
5. Wales P.W., Allen N., Worthington P., George D., Compher C., Teitelbaum D.; American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. A.S.P.E.N. clinical guidelines: support of pediatric patients with intestinal failure at risk of parenteral nutrition-associated liver disease // JPEN J. Parenter. Enteral Nutr. 2014. Vol. 38, N 5. P. 538-557. DOI: https://doi.org/10.1177/0148607114527772
6. Duggan C.P., Jaksic T. Pediatric intestinal failure // N. Engl. J. Med. 2017. Vol. 377, N 7. P. 666-675.
7. Bianchi A. Intestinal loop lengthening - a technique for increasing small intestinal length // J. Pediatr. Surg. 1980. Vol. 15, N 2. P. 145-151.
8. Kim H.B., Fauza D., Garza J. et al. Serial transverse enteroplasty (STEP): a novel bowel lengthening procedure // J. Pediatr. Surg. 2003. Vol. 38. P. 425-429.
9. Coletta R., Aldeiri B., Morabito A. Institutional experience with spiral intestinal lengthening and tailoring // Eur. J. Pediatr. Surg. 2019. Vol. 29, N 5. P. 412-416. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0038-1660850
10. Lauro A., Coletta R., Morabito A. Restoring gut physiology in short bowel patients: from bench to clinical application of autologous intestinal reconstructive procedures // Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2019. Vol. 13, N 8. P. 785-796. DOI: https://doi.org/10.1080/17474124.2019.1640600
11. Аверьянова Ю.В., Разумовский А.Ю., Макаров С.П., Петров Д.А., Брюсов Г.П., Кочкин В.С. и др. Современная стратегия лечения детей с синдромом короткой кишки: 12-летний опыт // Анестезиология и реаниматология. 2018. № 6. С. 67-74. DOI: https://doi.org/10.17116/anesthesiology201806167
12. Abi Nader E., Lambe C., Talbotec C., Pigneur B., Lacaille F., Garnier-Lengline H. et al. Outcome of home parenteral nutrition in 251 children over a 14-y period: report of a single center // Am. J. Clin. Nutr. 2016. Vol. 103. P. 1327-1336.
13. Norsa L. et al. Long term outcomes of intestinal rehabilitation in children with neonatal very short bowel syndrome: parenteral nutrition or intestinal transplantation // Clin. Nutr. 2019. Vol. 38, N 2. P. 926933.
14. Abu-Elmagd K.M. et al. Long-term survival, nutritional autonomy and quality of life after intestinal and multivisceral transplantation // Ann. Surg. 2012. Vol. 256, N 3. P. 494-508.
15. Spencer A.U. et al. Pediatric short bowel syndrome: redefining predictors of success // Ann. Surg. 2005. Vol. 242, N 3. P. 403-409.
16. Jones B.A., Hull M.A., Potanos K.M. et al. Report of 111 consecutive patients enrolled in the international serial transverse enteroplasty (STEP) data registry: a retrospective observational study // J. Am. Coll. Surg. 2013. Vol. 216. P. 438-446.
17. Safford S., Freemerman A., Safford K., Bentley R., Skinner M. Longitudinal mechanical tension induces growth in the small bowel of juvenile rats // Gut. 2005. Vol. 54. P. 1085-1090.
18. Luntz J., Brei D., Teitelbaum D., Spencer A. Mechanical extension implants for short-bowel syndrome // Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. 2006. Vol. 6173. P. 1-24.
19. Okawada M., Mustafa Maria H., Teitelbaum D.H. Distraction induced enterogenesis: a unique mouse model using polyethylene glycol // J. Surg. Res. 2011. Vol. 170. P. 41.
20. Fisher J.G. et al. Extraluminal distraction enterogenesis using shape-memory polymer // J. Pediatr. Surg. 2015. Vol. 50, N 6. P. 938-942.
21. Koga H., Sun X., Yang H., Nose K., Somara S., Bitar K.N. et al. Distraction-induced intestinal enterogenesis: preservation of intestinal function and lengthening after reimplantation into normal jejunum // Ann. Surg. 2012. Vol. 255, N 2. P. 302-310.
22. Sueyoshi R., Woods Ignatoski K.M., Okawada M., Teitelbaum D.H. Distraction-induced intestinal growth: the role of mechanotransduction mechanisms in a mouse model of short bowel syndrome // Tissue Eng. Part A. 2014. Vol. 20, N 3-4. P. 830-841.
23. Hosseini H.S., Wood L.S.Y., Taylor J.S. et al. Biomechanical signaling and collagen fiber reorientation during distraction enterogenesis // J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2020. Vol. 101. Article ID 103425. DOI: https://doi.org/10.1016/jjmbbm.2019.103425
24. Sullins V.F., Wagner J.P., Suwarnasarn A.T. et al. A novel biodegradable device for intestinal lengthening // J. Pediatr. Surg. 2014. Vol. 49. P. 109-113.
25. Rouch J.D., Huynh N., Scott A. et al. Scalability of an endoluminal spring for distraction enterogenesis // J. Pediatr. Surg. 2016. Vol. 51. P. 1988-1992.
26. Dubrovsky G., Huynh N., Thomas A.L., Shek-herdimian S., Dunn J.C. Intestinal lengthening via multiple in-continuity springs // J. Pediatr. Surg. 2019. Vol. 54, N 1. P. 39-43.
27. Woodruff M.A., Hutmacher D.W. The return of a forgotten polymer - polycaprolactone in the 21st century // Prog. Polym. Sci. 2010. Vol. 35. P. 1217-1256. DOI: https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2010.04.002
28. Morokov E.S., Demina V.A., Sedush N.G., Kalinin K.T., Khramtsova E.A., Dmitryakov P.V. et al. Noninvasive high-frequency acoustic microscopy for 3D visualization of microstructure and estimation of elastic properties during hydrolytic degradation of lactide and s-caprolactone polymers // Acta Biomater. 2020. Vol. 109. P. 61-72. DOI: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2020.04.011
29. Dubrovsky G., Taylor J.S., Thomas A.-L. et al. Optimization of in-continuity spring-mediated intestinal lengthening // J. Pediatr. Surg. 2020. Vol. 55, N 1. P. 158-163. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jpedsurg.2019.09.072
30. Hosseini H.S., Taylor J.S., Wood L.S.Y., Dunn J.C.Y. Biomechanics of small intestine during distraction enter-ogenesis with an intraluminal spring // J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2020. Vol. 101. Article ID 103413. DOI: https://doi.org/10.1016/jjmbbm.2019.103413