Травматическое повреждение суставов - особенно частая патология у
военнослужащих с интенсивной боевой и физической подготовкой, профессиональных
спортсменов и молодых людей с высоким уровнем физической активности. В
структуре всех травм нижних конечностей у военнослужащих повреждения коленного
сустава составляют 46%, посттравматические изменения гиалинового хряща
наблюдаются в 24,8% травм [1]. Вследствие повреждений в суставном хряще,
субхондральной кости, менисках и связках развиваются дегенеративные процессы, а
также образуются остеофиты, проявляющиеся симптоматикой остеоартрита (ОА)
[2] и трудно поддающиеся лечению.
ОА развивается в 80% случаев травм
коленных суставов у людей трудоспособного возраста [3]. Гистологическое
своеобразие структуры гиалинового хряща (отсутствие кровеносных сосудов,
лимфодренажа и нервных окончаний), субстратное и метаболическое обеспечение
хондроцитов главным образом из синовиальной жидкости объясняют крайне
ограниченный потенциал хряща к самопроизвольной регенерации и низкую эффективность лечения
пациентов с ОА [4].
Травмы суставов сопровождаются усилением
секреции клетками синовиальной жидкости, появлением воспалительных цитокинов,
запускающих порочный круг патогенеза и усиливающих дальнейшее повреждение
хряща. Механизмы вторичной альтерации, в том числе действие металломатриксных
протеиназ, запускаемых провоспалительными цитокинами, разрушают
структурные коллагеновые и протеогликановые компоненты хрящевой
ткани, окружающей зону дефекта. В свою очередь, это увеличивает
область повреждения и продукцию синовиальной жидкости со снижением ее
вязкости, а также способствует развитию дегенеративных изменений в хряще
[5-7].
Существуют общепринятые хирургические
методы лечения повреждений гиалинового хряща: туннелизация, микрофрактурирование,
мозаичная хондропластика, пересадка аутологичных хондроцитов,
использование коллагеновых мембран и других видов "заплаток" хряща.
Показания к использованию той или иной методики зависят от глубины и
площади повреждения хряща и субхондральной кости.
Создание каналов в области дефекта хряща с
подлежащим костным мозгом (туннелизация) призвано обеспечить
рекрутирование мультипотентных стромальных клеток костного мозга, однако
показывает недостаточно хорошие результаты в виде образования фиброхрящевой
ткани со снижением функции сустава [8]. Предположительно это связано с
низким регенеративным потенциалом самой хрящевой ткани [9, 10].
Трансплантация пациент-специфических
хондроцитов - это двухэтапное вмешательство в сустав, сопряженное с
дорогостоящей и длительной процедурой выделения, типирования и культивирования
аутологичных клеток и не гарантирующее образования гиалинового хряща [11].
Мозаичная хондропластика - сложная
хирургическая процедура пересадки цилиндрических трансплантатов из
ненагружаемой и неповрежденной суставной поверхности в зону дефекта хряща.
Результаты этого метода лечения существенно зависят от возраста, пола пациента
и размера поражения, но основной проблемой данного метода остается
лимитированность донорской ткани.
Тканевая инженерия становится
перспективной альтернативой существующих подходов. Для создания
тканеинженерного хряща разрабатывают бесклеточные конструкты, которые в
дальнейшем могут быть заселены пациент-специфическими клетками как
перед трансплантацией, так и при функционировании внедренной
конструкции. Гидрогели, созданные на основе бесклеточного матрикса,
представляют собой интересный инновационный способ работы с матриксом.
Инъекционную форму матрикса можно использовать для создания индивидуальных
трансплантатов, заполняющих полость дефекта. Особенно значимым мы считаем
поиск оптимального гомологичного биоматериала для изготовления матрикса и
гидрогеля на его основе, который будет адекватен природной микросреде
хондроцитов человека [12].
Цель - экспериментально показать эффективность внутрисуставного применения
гидрогеля из пуповины человека в лечении повреждения гиалинового хряща.
Материал и методы
Получение гидрогеля из биоматериала пуповины человека
Гидрогель из пуповины человека был
изготовлен в лаборатории тканевой инженерии НИЦ "Военно-медицинской академии
им. С.М. Кирова" (г. Санкт-Петербург) с применением методов децеллюляризации,
гомогенизации, ферментативного расщепления, лиофильной сушки и
стерилизации. Качество удаления клеток контролировали световой
микроскопией окрашенных препаратов и количественным определением ДНК с
использованием наборов реактивов InstaGene matrix (BioRad, USA) в
соответствии с инструкциями производителя на спектрофотометре Implen
NanoPhotometer NP80 Touch (GmbH, Germany), анализ каждого образца выполняли
трижды [13].
Эксперимент на животных. Исследование проводили на 15 кроликах породы шиншилла в соответствии
с требованиями гуманного обращения и рекомендациями Конвенции Совета
Европы по использованию животных в научных целях.
Травматическое повреждение нагружаемой
поверхности медиального мыщелка правой бедренной кости моделировали под
комбинированной анестезией (раствор пропофола 1% - 2 мл, диэтиловый эфир -
15 мл) через медиальный парапателлярный доступ, формируя сверлом
костно-хрящевой дефект диаметром и глубиной 3 мм. Для профилактики возникновения
контрактур иммобилизацию оперированной конечности не проводили.
Профилактику инфекционных осложнений
осуществляли однократным внутримышечным введением цефтриаксона в дозе 10 мг/кг.
Животным контрольной группы (n=8) троекратно (на 14, 21 и 28-е сутки
после операции моделирования дефекта) в полость сустава вводили 0,4 мл
стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Животным экспериментальной
группы (n=7) в те же сроки в
полость сустава вводили 0,4 мл гидрогеля из бесклеточного матрикса пуповины.
Оценка глубины и диаметра сформированного дефекта
Спустя 60 дней после моделирования
костнохрящевого дефекта выполняли магнитно-резонансную томографию (МРТ)
коленных суставов для определения фактических диаметра и глубины дефектов
под влиянием лечения на Т2-взвешенных сериях (Philips Achieva 1.5T, USA).
Статистический анализ
Статистическую обработку выполняли с
помощью программы StatSoft Statistica 6.1. Результаты представляли в виде
медианы, 25-го и 75-го перцентилей, если распределение признака
не соответствовало нормальному. Достоверность различий концентрации ДНК в
гидрогеле, диаметра и глубины дефекта коленного сустава на
магнитнорезонансных томограммах в зависимых выборках рассчитывали методом
непараметрической статистики (критерий Вилкоксона). Диаметр и глубину дефектов
хряща в двух исследовательских группах сравнивали методом
непараметрической статистики U-критерия Манна-Уитни. За
критический уровень значимости принимали р<0,05 [14].
Результаты
Концентрация ДНК в нативном гомогенате
соединительной ткани пуповины колебалась от 453,65 до 475,15 нг/мл (среднее -
468,75±12,15 нг/мкл). В бесклеточном матриксе, из которого
изготовляли инъекционный гидрогель, содержание ДНК находилось в диапазоне
от 27,80 до 30,70 нг/мкл (среднее - 29,20±2,09 нг/мкл). Снижение концентрации
ДНК оказалось статистически значимым (р<0,001). Это
соответствует общепринятым критериям, минимизирующим риск возникновения
иммунных реакций.
Изменение диаметра и глубины дефекта
суставной поверхности под влиянием лечения через 60 дней после моделирования
дефекта
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,455,,4,photo1,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Примечания: р1<0,05 - различия достоверны относительно исходного размера
дефекта; р2<0,05 - различия достоверны при сравнении между двумя
группами животных.
Послеоперационный и постинъекционный
периоды у животных протекали без признаков синовита, раневой инфекции, общих
симптомов воспаления. Ректальная термометрия не выявляла повышения температуры
>38 оС.
Под влиянием проводимого лечения размеры
дефектов суставного хряща в обеих группах разнонаправленно изменялись (рис. 1).
Результаты измерений представлены в таблице.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,455,,4,photo2,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Диаметр и глубина дефекта суставной поверхности спустя 60 дней
после моделирования дефекта: А, Б - у животных контрольной
группы; В, Г - у кроликов
экспериментальной группы
Fig. 1. Diameter and depth of the joint surface defect 60
days after modeling the defect: А, B - in animals of the control group; С, D - in rabbits
of the experimental group as a result of treatment
Обнаружено, что спустя 60 дней после
создания дефекта его средний диаметр у животных контрольной группы, которым
внутрисуставно инъецировали стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, достоверно
превышал исходный (p=0,018). Существенных
изменений глубины дефекта в этот срок исследования не зафиксировано.
Увеличение размера повреждения может быть объяснено вторичной альтерацией,
закономерно возникающей на этапах патогенеза травм.
Выявлено существенное уменьшение диаметра
и глубины повреждения в группе животных, которых лечили внутрисуставным
введением гидрогеля пуповины (p=0,028
и p=0,018 соответственно).
Анализ размеров дефектов через 60 дней
после их моделирования и под влиянием проводимого лечения показал, что и
диаметр, и глубина повреждений суставного хряща животных
контрольной группы статистически значимо отличаются от соответствующих
характеристик повреждений в экспериментальной группе (p=0,001 и p=0,007
соответственно).
Обсуждение
Главная цель исследователей в области
тканевой инженерии при создании матриксов - сохранить архитектуру ткани.
Жесткая процедура удаления клеток из ткани способна изменять структуру
внеклеточного каркаса. Эти изменения могут накладываться на модификации
структурных элементов, которые возникают в течение жизни донора под влиянием
заболеваний, возрастных изменений, патологического ремоделирования,
поэтому поиск биологического материала для получения матрикса в
условиях лимитированности донорского материала и его постнатальных особенностей
неминуемо направлен в сторону органов и тканей, лишенных возрастных и
патологических изменений, - провизорных органов. Будучи гомологичными
внеэмбриональными тканями, они сохраняют фетальный фенотип внеклеточного
матрикса: факторы роста, адгезивные сайты, особенности структурных волокон,
обилие и доминирование высокомолекулярного гиалуронана, специфический
ансамбль цитокинов. Известно, что при децеллюляризации факторы роста
и молекулы адгезии сохраняются на структурных компонентах матрикса [15].
Мы выдвигаем гипотезу о том, что
компоненты бесклеточного матрикса в инъекционной (гидрогелевой) форме способны
обладать такими же биомиметическими свойствами, как и сами трехмерные
бесклеточные тканеспецифические матриксы. В нашем исследовании мы
используем макромолекулы матриксов вместо их пространственных конструкций.
Гидрогели, созданные на основе
внеклеточного матрикса (ВКМ) [16], представляют собой интересный и
инновационный способ работы с матриксом. Особо значимым мы считаем
использование подходящего биоматериала для получения матрикса. Твердая
слизистая соединительная ткань пуповины человека, в зарубежной
литературе именуемая вартоновым студнем (Wharton's Jelly), состоит из
ВКМ, по составу сходного с матриксом гиалинового хряща и представленного
коллагенами разных типов, гликопротеинами, протеогликанами. Каждый из них по
отдельности исследуется в тканевой инженерии как самостоятельный
агент с регенеративными возможностями [17]. ВКМ пуповины биосовместим с
матриксом гиалинового хряща, на нем фиксированы и сохраняются
после децеллюляризации факторы роста: трансформирующий фактор роста
TGF-P3, мотивирующий хондроциты к выработке коллагена II и
аггрекана. Благодаря высокому содержанию гиалуронана большой
молекулярной массы ВКМ пуповины может быть солюбилизирован в
инъекционный гидрогель с регулируемой вязкостью и способностью
полимеризоваться в физиологических условиях, повышая вязкость синовиальной
жидкости и заполняя дефекты хрящевой выстилки сустава [14, 18, 19].
Примененная нами щадящая процедура децеллюляризации
соединительной ткани пуповины оказалась эффективной; концентрация ДНК в
полученном продукте соответствовала требуемым критериям [20]. Сохранность
основных компонентов нативной ткани после процедуры децеллюляризации
верифицирована гистологическими методами окрашивания матрикса альциановым синим (гиалуронан),
по Ван-Гизону (коллагены), орсеином (эластин) [12]. Полнокомпонентный
бесклеточный матрикс соединительной ткани пуповины был солюбилизирован в
инъекционную форму с вязкостью, позволяющей вводить его в
полость сустава через иглу для инъекций.
Способность инъекционного гидрогеля к
полимеризации была проверена in vitro (рис. 2) и in
vivo.
Введение инъекционного гидрогеля в полость
суставов экспериментальных животных заполняло моделированный дефект (рис.
3) и, как было показано выше, способствовало образованию хрящевой ткани.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,455,,4,photo3,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. Гидрогель, полимеризованный in vitro
Fig. 2. The hydrogel was polymerized in vitro
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,455,,4,photo4,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 3. Макропрепарат коленного сустава кролика.
Кумуляция окрашенного метиленовым синим гидрогеля в зоне повреждения суставного
хряща
Fig. 3. Rabbit knee joint. Accumulation of methylene blue-colored hydrogel
in the area of articular cartilage damage
Таким образом, исходное
предположение о сохранности в гидрогелевой форме биомиметических свойств
матрикса пуповины было подтверждено в эксперименте при восстановлении
повреждения суставного хряща. Уменьшение размеров дефекта к 60-м
суткам, отсутствие признаков воспаления при внутрисуставном введении
подтверждает биосовместимость и регенераторные свойства полученного гидрогеля.
Продолжаются исследования по гистологической оценке вновь образованной хрящевой
ткани в зоне дефекта.
Выводы
1. Полученный в нашей
лаборатории бесклеточный продукт из пуповины для внутрисуставного введения
отвечает существующим стандартам содержания ДНК, полимеризуется in
vitro и in vivo, биосовместим.
2. Внутрисуставное
введение бесклеточного инъекционного гидрогеля из пуповины приводит к
частичному уменьшению диаметра и глубины моделированного травматического
повреждения суставного хряща кролика.
Литература
1. Федоров Р.А., Хоминец В.В., Шаповалов
В.М. и др. Объективная рентгенологическая диагностика повреждений передней
крестообразной связки коленного сустава у военнослужащих // Военно-медицинский журнал. 2016. Т. 337, № 2. С. 28-30.
2. Jiang Y.Z., Zhang
S.F., Qi Y.Y. et al. Cell transplantation for articular cartilage defects: principles of
past, present, and future practice // Cell Transplant. 2011. Vol. 20.
P. 593-607.
3.
Kramer W.C., Hendricks K.J., Wang J. Pathogenetic mechanisms
of posttraumatic osteoarthritis: opportunities for early intervention // Int.
J. Clin. Exp. Med. 2011. Vol. 4, N 4. P. 285-298.
4. Котельников Г.П., Волова Л.Т., Долгушин
ДА. и др. Особенности регенеративных процессов
области пластики костно-хрящевых дефектов комбинированными трансплантатами на
основе аутологичных и аллогенных клеток из
реберной хрящевой ткани в эксперименте у кроликов // Материалы X Юбилейного
Всероссийского съезда травматологов-ортопедов. Человек и его здоровье. Москва, 2014. С. 460.
5.
Goldring M.B., Otero M. Inflammation in osteoarthritis //
Curr. Opin. Rheumatol. 2011. Vol. 23, N 5. P. 471-478. DOI: https://doi.org/10.1097/B0R.0b013e328349c2b1
6.
Larsson S., Englund M., Struglics A. Interleukin-6 and tumor
necrosis factor alpha in synovial fluid are associated with progression of
radiographic knee osteoarthritis in subjects with previous meniscectomy //
Osteoarthritis Cartilage. 2015. Vol. 3, N 11. P. 1906-1914.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.joca.2015.05.035
7. Матвеева Е.Л., Лунева С.Н., Чегуров
О.К., Макушин В.Д. Анализ связи биохимических показателей синовиальной жидкости
больных остеоартрозами коленного сустава с их клинической характеристикой // Травматология и ортопедия России. 2006. Т. 42, № 4. С. 55-58.
8.
Seo S.S. Management of focal chondral lesion in the knee
joint // Knee Surg. Relat. Res. 2011. Vol. 23, N 4. P. 185-196.
9.
Huang H., Zhang X., Hu X. A functional biphasic biomaterial
homing mesenchymal stem cells for in vivo cartilage regeneration //
Biomaterials. 2014. Vol. 35. P 608-619.
10.
Kusuma G.D., Carthew J., Lim R. Effect of the
microenvironment on mesenchymal stem cell paracrine signaling: opportunities to
engineer the therapeutic effect // Stem Cells Dev. 2017. Vol. 26. P.
617-631.
11.
Roberts S. Immunohistochemical study of collagen types I and
II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous
chondrocyte implantation // Knee. 2009. Vol. 16, N 5. P 398-404.
12.
Калюжная Л.И., Хоминец В.В., Чеботарёв С.В. и др. Применение биоматериала из пуповины человека для
восстановления повреждений суставного хряща // Профилактическая и
клиническая медицина. 2019. Т. 73, № 4. С. 45-52.
13. Товпеко Д.В., Калюжная Л.И., Чеботарёв
С.В., Меньшиков Н.О. Децеллюляризация ткани пуповины человека как перспективный
метод получения бесклеточного матрикса для регенеративной медицины и
тканевой инженерии // Сборник тезисов VI Международной конференции молодых
ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и
вирусологов. Новосибирск : ИПЦ НГУ. 2019. Т. 4. С. 646-649. URL: https://www.openbio.ru/openbio_tezis_2019.pdf
14. Реброва О.Ю.
Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. Москва : Медиа Сфера, 2006, 312 с.
15.
Leung А., Crombleholme T.M., Keswani S.G. Fetal wound healing: implications for minimal
scar formation // Curr. Opin. Pediatr. 2015. Vol. 24, N 3. P.
371-378.
16.
Toh W.S., Brittberg M., Farr J. et al. Cellular senescence in
aging and osteoarthritis // Acta Orthop. 2016. Vol. 87. P. 6-14.
DOI: https://doi.org/10.1080/17453674.2016.1235087
17.
Pawitan J.A. Prospect of stem cell conditioned medium in
regenerative medicine // Biomed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. Article ID
965849.
18.
Koci Z., Vyborny K., Dubisova J. et al. Extracellular matrix
hydrogel derived from human umbilical cord as a scaffold for neural tissue
repair and its comparison with extracellular matrix from porcine tissues
// Tissue Eng. Part C Methods. 2017. Vol. 23, N 6. P. 333-345. DOI: https://doi.org/10.1089/ten.tec.2017.0089
19.
Zhao P., Liu S., Bai Y. et al. hWJECM-derived oriented
scaffolds with autologous chondrocytes for rabbit cartilage defect
repairing // Tissue Eng. Part A. 2018.Vol. 24, N 11-12. P. 905-914.
DOI: https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2017.0223
20.
Badylak S.F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue
as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the
host response // Ann. Biomed. Eng. 2014. Vol. 42. P. 1517-1524. DOI: https://doi.org/10.1007/s10439-013-0963-7