Регенеративные эффекты гидрогеля из биоматериала пуповины человека в восстановлении повреждений суставного хряща

Резюме

Травмы суставного хряща - основной фактор риска развития остеоартрита.

Цель исследования - экспериментально показать эффективность внутрисуставного применения гидрогеля из пуповины человека в лечении повреждения гиалинового хряща.

Материал и методы. Гидрогель из слизистой соединительной ткани пуповины человека изготовлен с использованием следующих методов: децеллюляризации, гомогенизации, ферментативного расщепления, лиофильной сушки и стерилизации. Количественно содержание ДНК в нативной и децеллюляризованной пуповине оценивали с помощью спектрофотометрии. У животных формировали костно-хрящевой дефект мыщелка бедренной кости диаметром и глубиной 3 мм. Животным 1-й группы (8 кроликов) в полость коленного сустава трижды вводили 0,9% раствор натрия хлорида, 2-й группы (7 кроликов) - гидрогель из пуповины. Через 60 сут проводили магнитно-резонансное томографическое исследование коленных суставов c измерением глубины и диаметра дефекта.

Результаты. Эффективность удаления клеток из соединительной ткани пуповины подтверждена низким содержанием ДНК в гидрогеле (29,2 нг/мкл). С помощью магнитно-резонансной томографии выявлено статистически значимое (р=0,018) увеличение диаметра повреждения в 1-й группе через 60 сут. У животных 2-й группы диаметр и глубина повреждения значимо уменьшились (р<0,017 и р<0,028 соответственно).

Заключение. Бесклеточный гидрогель из соединительной ткани пуповины, полученный в нашей лаборатории, отвечает существующим стандартам содержания ДНК, способен полимеризоваться и не вызывает воспалительных реакций при внутрисуставном введении. Использование гидрогеля из пуповины для лечения травматических повреждений коленных суставов кроликов приводит к частичному уменьшению глубины и площади дефектов суставного хряща.

Ключевые слова:матрикс, скаффолд, децеллюляризация, вартонов студень, пуповина, магнитно-резонансная томография, остеоартрит, тканевая инженерия

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Экспериментальная работа с животными, моделирование дефекта суставов - Чеботарев С.В.; изготовление бесклеточного матрикса - Калюжная Л.И., Протасов О.В.; разработка модели травматического повреждения внутрисуставного хряща - Хоминец В.В.; определение концентрации ДНК в продуктах - Чернов В.Е.; сбор пуповин сразу после рождения ребенка - Фрумкина А.С.; статистическая обработка результатов - Земляной Д.А.; написание, стилистическая и орфографическая обработка рукописи, подготовка к печати - Шайтор В.М.; децеллюляризации биоматериала - Товпеко Д.В.; программное определение размеров дефектов на этапах исследования - Малеков Д.А.
Для цитирования: Чеботарев С.В., Калюжная Л.И., Хоминец В.В., Чернов В.Е., Фрумкина А.С., Земляной Д.А., Шайтор В.М., Товпеко Д.В., Малеков Д.А., Протасов О.В. Регенеративные эффекты гидрогеля из биоматериала пуповины человека в восстановлении повреждений суставного хряща // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2020. Т. 8, № 4. С. 119-125. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-1198-2020-8-4-119-125 

Травматическое повреждение суставов - особенно частая патология у военнослужащих с интенсивной боевой и физической подготовкой, профессиональных спортсменов и молодых людей с высоким уровнем физической активности. В структуре всех травм нижних конечностей у военнослужащих повреждения коленного сустава составляют 46%, посттравматические изменения гиалинового хряща наблюдаются в 24,8% травм [1]. Вследствие повреждений в суставном хряще, субхондральной кости, менисках и связках развиваются дегенеративные процессы, а также образуются остеофиты, проявляющиеся симптоматикой остеоартрита (ОА) [2] и трудно поддающиеся лечению.

ОА развивается в 80% случаев травм коленных суставов у людей трудоспособного возраста [3]. Гистологическое своеобразие структуры гиалинового хряща (отсутствие кровеносных сосудов, лимфодренажа и нервных окончаний), субстратное и метаболическое обеспечение хондроцитов главным образом из синовиальной жидкости объясняют крайне ограниченный потенциал хряща к самопроизвольной регенерации и низкую эффективность лечения пациентов с ОА [4].

Травмы суставов сопровождаются усилением секреции клетками синовиальной жидкости, появлением воспалительных цитокинов, запускающих порочный круг патогенеза и усиливающих дальнейшее повреждение хряща. Механизмы вторичной альтерации, в том числе действие металломатриксных протеиназ, запускаемых провоспалительными цитокинами, разрушают структурные коллагеновые и протеогликановые компоненты хрящевой ткани, окружающей зону дефекта. В свою очередь, это увеличивает область повреждения и продукцию синовиальной жидкости со снижением ее вязкости, а также способствует развитию дегенеративных изменений в хряще [5-7].

Существуют общепринятые хирургические методы лечения повреждений гиалинового хряща: туннелизация, микрофрактурирование, мозаичная хондропластика, пересадка аутологичных хондроцитов, использование коллагеновых мембран и других видов "заплаток" хряща. Показания к использованию той или иной методики зависят от глубины и площади повреждения хряща и субхондральной кости.

Создание каналов в области дефекта хряща с подлежащим костным мозгом (туннелизация) призвано обеспечить рекрутирование мультипотентных стромальных клеток костного мозга, однако показывает недостаточно хорошие результаты в виде образования фиброхрящевой ткани со снижением функции сустава [8]. Предположительно это связано с низким регенеративным потенциалом самой хрящевой ткани [9, 10].

Трансплантация пациент-специфических хондроцитов - это двухэтапное вмешательство в сустав, сопряженное с дорогостоящей и длительной процедурой выделения, типирования и культивирования аутологичных клеток и не гарантирующее образования гиалинового хряща [11].

Мозаичная хондропластика - сложная хирургическая процедура пересадки цилиндрических трансплантатов из ненагружаемой и неповрежденной суставной поверхности в зону дефекта хряща. Результаты этого метода лечения существенно зависят от возраста, пола пациента и размера поражения, но основной проблемой данного метода остается лимитированность донорской ткани.

Тканевая инженерия становится перспективной альтернативой существующих подходов. Для создания тканеинженерного хряща разрабатывают бесклеточные конструкты, которые в дальнейшем могут быть заселены пациент-специфическими клетками как перед трансплантацией, так и при функционировании внедренной конструкции. Гидрогели, созданные на основе бесклеточного матрикса, представляют собой интересный инновационный способ работы с матриксом. Инъекционную форму матрикса можно использовать для создания индивидуальных трансплантатов, заполняющих полость дефекта. Особенно значимым мы считаем поиск оптимального гомологичного биоматериала для изготовления матрикса и гидрогеля на его основе, который будет адекватен природной микросреде хондроцитов человека [12].

Цель - экспериментально показать эффективность внутрисуставного применения гидрогеля из пуповины человека в лечении повреждения гиалинового хряща.

Материал и методы

Получение гидрогеля из биоматериала пуповины человека

Гидрогель из пуповины человека был изготовлен в лаборатории тканевой инженерии НИЦ "Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова" (г. Санкт-Петербург) с применением методов децеллюляризации, гомогенизации, ферментативного расщепления, лиофильной сушки и стерилизации. Качество удаления клеток контролировали световой микроскопией окрашенных препаратов и количественным определением ДНК с использованием наборов реактивов InstaGene matrix (BioRad, USA) в соответствии с инструкциями производителя на спектрофотометре Implen NanoPhotometer NP80 Touch (GmbH, Germany), анализ каждого образца выполняли трижды [13].

Эксперимент на животных. Исследование проводили на 15 кроликах породы шиншилла в соответствии с требованиями гуманного обращения и рекомендациями Конвенции Совета Европы по использованию животных в научных целях.

Травматическое повреждение нагружаемой поверхности медиального мыщелка правой бедренной кости моделировали под комбинированной анестезией (раствор пропофола 1% - 2 мл, диэтиловый эфир - 15 мл) через медиальный парапателлярный доступ, формируя сверлом костно-хрящевой дефект диаметром и глубиной 3 мм. Для профилактики возникновения контрактур иммобилизацию оперированной конечности не проводили.

Профилактику инфекционных осложнений осуществляли однократным внутримышечным введением цефтриаксона в дозе 10 мг/кг.

Животным контрольной группы (n=8) троекратно (на 14, 21 и 28-е сутки после операции моделирования дефекта) в полость сустава вводили 0,4 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Животным экспериментальной группы (n=7) в те же сроки в полость сустава вводили 0,4 мл гидрогеля из бесклеточного матрикса пуповины.

Оценка глубины и диаметра сформированного дефекта

Спустя 60 дней после моделирования костнохрящевого дефекта выполняли магнитно-резонансную томографию (МРТ) коленных суставов для определения фактических диаметра и глубины дефектов под влиянием лечения на Т2-взвешенных сериях (Philips Achieva 1.5T, USA).

Статистический анализ

Статистическую обработку выполняли с помощью программы StatSoft Statistica 6.1. Результаты представляли в виде медианы, 25-го и 75-го перцентилей, если распределение признака не соответствовало нормальному. Достоверность различий концентрации ДНК в гидрогеле, диаметра и глубины дефекта коленного сустава на магнитнорезонансных томограммах в зависимых выборках рассчитывали методом непараметрической статистики (критерий Вилкоксона). Диаметр и глубину дефектов хряща в двух исследовательских группах сравнивали методом непараметрической статистики U-критерия Манна-Уитни. За критический уровень значимости принимали р<0,05 [14].

Результаты

Концентрация ДНК в нативном гомогенате соединительной ткани пуповины колебалась от 453,65 до 475,15 нг/мл (среднее - 468,75±12,15 нг/мкл). В бесклеточном матриксе, из которого изготовляли инъекционный гидрогель, содержание ДНК находилось в диапазоне от 27,80 до 30,70 нг/мкл (среднее - 29,20±2,09 нг/мкл). Снижение концентрации ДНК оказалось статистически значимым (р<0,001). Это соответствует общепринятым критериям, минимизирующим риск возникновения иммунных реакций.

Изменение диаметра и глубины дефекта суставной поверхности под влиянием лечения через 60 дней после моделирования дефекта

Примечания: р1<0,05 - различия достоверны относительно исходного размера дефекта; р2<0,05 - различия достоверны при сравнении между двумя группами животных.

Послеоперационный и постинъекционный периоды у животных протекали без признаков синовита, раневой инфекции, общих симптомов воспаления. Ректальная термометрия не выявляла повышения температуры >38 оС.

Под влиянием проводимого лечения размеры дефектов суставного хряща в обеих группах разнонаправленно изменялись (рис. 1). Результаты измерений представлены в таблице.

Рис. 1. Диаметр и глубина дефекта суставной поверхности спустя 60 дней после моделирования дефекта: А, Б - у животных контрольной группы; В, Г - у кроликов экспериментальной группы

Fig. 1. Diameter and depth of the joint surface defect 60 days after modeling the defect: А, B - in animals of the control group; С, D - in rabbits of the experimental group as a result of treatment

Обнаружено, что спустя 60 дней после создания дефекта его средний диаметр у животных контрольной группы, которым внутрисуставно инъецировали стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, достоверно превышал исходный (p=0,018). Существенных изменений глубины дефекта в этот срок исследования не зафиксировано. Увеличение размера повреждения может быть объяснено вторичной альтерацией, закономерно возникающей на этапах патогенеза травм.

Выявлено существенное уменьшение диаметра и глубины повреждения в группе животных, которых лечили внутрисуставным введением гидрогеля пуповины (p=0,028 и p=0,018 соответственно).

Анализ размеров дефектов через 60 дней после их моделирования и под влиянием проводимого лечения показал, что и диаметр, и глубина повреждений суставного хряща животных контрольной группы статистически значимо отличаются от соответствующих характеристик повреждений в экспериментальной группе (p=0,001 и p=0,007 соответственно).

Обсуждение

Главная цель исследователей в области тканевой инженерии при создании матриксов - сохранить архитектуру ткани. Жесткая процедура удаления клеток из ткани способна изменять структуру внеклеточного каркаса. Эти изменения могут накладываться на модификации структурных элементов, которые возникают в течение жизни донора под влиянием заболеваний, возрастных изменений, патологического ремоделирования, поэтому поиск биологического материала для получения матрикса в условиях лимитированности донорского материала и его постнатальных особенностей неминуемо направлен в сторону органов и тканей, лишенных возрастных и патологических изменений, - провизорных органов. Будучи гомологичными внеэмбриональными тканями, они сохраняют фетальный фенотип внеклеточного матрикса: факторы роста, адгезивные сайты, особенности структурных волокон, обилие и доминирование высокомолекулярного гиалуронана, специфический ансамбль цитокинов. Известно, что при децеллюляризации факторы роста и молекулы адгезии сохраняются на структурных компонентах матрикса [15].

Мы выдвигаем гипотезу о том, что компоненты бесклеточного матрикса в инъекционной (гидрогелевой) форме способны обладать такими же биомиметическими свойствами, как и сами трехмерные бесклеточные тканеспецифические матриксы. В нашем исследовании мы используем макромолекулы матриксов вместо их пространственных конструкций.

Гидрогели, созданные на основе внеклеточного матрикса (ВКМ) [16], представляют собой интересный и инновационный способ работы с матриксом. Особо значимым мы считаем использование подходящего биоматериала для получения матрикса. Твердая слизистая соединительная ткань пуповины человека, в зарубежной литературе именуемая вартоновым студнем (Wharton's Jelly), состоит из ВКМ, по составу сходного с матриксом гиалинового хряща и представленного коллагенами разных типов, гликопротеинами, протеогликанами. Каждый из них по отдельности исследуется в тканевой инженерии как самостоятельный агент с регенеративными возможностями [17]. ВКМ пуповины биосовместим с матриксом гиалинового хряща, на нем фиксированы и сохраняются после децеллюляризации факторы роста: трансформирующий фактор роста TGF-P3, мотивирующий хондроциты к выработке коллагена II и аггрекана. Благодаря высокому содержанию гиалуронана большой молекулярной массы ВКМ пуповины может быть солюбилизирован в инъекционный гидрогель с регулируемой вязкостью и способностью полимеризоваться в физиологических условиях, повышая вязкость синовиальной жидкости и заполняя дефекты хрящевой выстилки сустава [14, 18, 19].

Примененная нами щадящая процедура децеллюляризации соединительной ткани пуповины оказалась эффективной; концентрация ДНК в полученном продукте соответствовала требуемым критериям [20]. Сохранность основных компонентов нативной ткани после процедуры децеллюляризации верифицирована гистологическими методами окрашивания матрикса альциановым синим (гиалуронан), по Ван-Гизону (коллагены), орсеином (эластин) [12]. Полнокомпонентный бесклеточный матрикс соединительной ткани пуповины был солюбилизирован в инъекционную форму с вязкостью, позволяющей вводить его в полость сустава через иглу для инъекций.

Способность инъекционного гидрогеля к полимеризации была проверена in vitro (рис. 2) и in vivo.

Введение инъекционного гидрогеля в полость суставов экспериментальных животных заполняло моделированный дефект (рис. 3) и, как было показано выше, способствовало образованию хрящевой ткани.

Рис. 2. Гидрогель, полимеризованный in vitro

Fig. 2. The hydrogel was polymerized in vitro

Рис. 3. Макропрепарат коленного сустава кролика. Кумуляция окрашенного метиленовым синим гидрогеля в зоне повреждения суставного хряща

Fig. 3. Rabbit knee joint. Accumulation of methylene blue-colored hydrogel in the area of articular cartilage damage

Таким образом, исходное предположение о сохранности в гидрогелевой форме биомиметических свойств матрикса пуповины было подтверждено в эксперименте при восстановлении повреждения суставного хряща. Уменьшение размеров дефекта к 60-м суткам, отсутствие признаков воспаления при внутрисуставном введении подтверждает биосовместимость и регенераторные свойства полученного гидрогеля. Продолжаются исследования по гистологической оценке вновь образованной хрящевой ткани в зоне дефекта.

Выводы

1.    Полученный в нашей лаборатории бесклеточный продукт из пуповины для внутрисуставного введения отвечает существующим стандартам содержания ДНК, полимеризуется in vitro и in vivo, биосовместим.

2.    Внутрисуставное введение бесклеточного инъекционного гидрогеля из пуповины приводит к частичному уменьшению диаметра и глубины моделированного травматического повреждения суставного хряща кролика.

Литература

1. Федоров Р.А., Хоминец В.В., Шаповалов В.М. и др. Объективная рентгенологическая диагностика повреждений передней крестообразной связки коленного сустава у военнослужащих // Военно-медицинский журнал. 2016. Т. 337, № 2. С. 28-30.

2.    Jiang Y.Z., Zhang S.F., Qi Y.Y. et al. Cell transplantation for articular cartilage defects: principles of past, present, and future practice // Cell Transplant. 2011. Vol. 20. P. 593-607.

3.    Kramer W.C., Hendricks K.J., Wang J. Pathogenetic mechanisms of posttraumatic osteoarthritis: opportunities for early intervention // Int. J. Clin. Exp. Med. 2011. Vol. 4, N 4. P. 285-298.

4. Котельников Г.П., Волова Л.Т., Долгушин ДА. и др. Особенности регенеративных процессов области пластики костно-хрящевых дефектов комбинированными трансплантатами на основе аутологичных и аллогенных клеток из реберной хрящевой ткани в эксперименте у кроликов // Материалы X Юбилейного Всероссийского съезда травматологов-ортопедов. Человек и его здоровье. Москва, 2014. С. 460.

5.    Goldring M.B., Otero M. Inflammation in osteoarthritis // Curr. Opin. Rheumatol. 2011. Vol. 23, N 5. P. 471-478. DOI: https://doi.org/10.1097/B0R.0b013e328349c2b1

6.    Larsson S., Englund M., Struglics A. Interleukin-6 and tumor necrosis factor alpha in synovial fluid are associated with progression of radiographic knee osteoarthritis in subjects with previous meniscectomy // Osteoarthritis Cartilage. 2015. Vol. 3, N 11. P. 1906-1914. DOI: https://doi.org/10.1016/j.joca.2015.05.035

7. Матвеева Е.Л., Лунева С.Н., Чегуров О.К., Макушин В.Д. Анализ связи биохимических показателей синовиальной жидкости больных остеоартрозами коленного сустава с их клинической характеристикой // Травматология и ортопедия России. 2006. Т. 42, № 4. С. 55-58.

8.    Seo S.S. Management of focal chondral lesion in the knee joint // Knee Surg. Relat. Res. 2011. Vol. 23, N 4. P. 185-196.

9.    Huang H., Zhang X., Hu X. A functional biphasic biomaterial homing mesenchymal stem cells for in vivo cartilage regeneration // Biomaterials. 2014. Vol. 35. P 608-619.

10.    Kusuma G.D., Carthew J., Lim R. Effect of the microenvironment on mesenchymal stem cell paracrine signaling: opportunities to engineer the therapeutic effect // Stem Cells Dev. 2017. Vol. 26. P. 617-631.

11.    Roberts S. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation // Knee. 2009. Vol. 16, N 5. P 398-404.

12.    Калюжная Л.И., Хоминец В.В., Чеботарёв С.Ви др. Применение биоматериала из пуповины человека для восстановления повреждений суставного хряща // Профилактическая и клиническая медицина. 2019. Т. 73, № 4. С. 45-52.

13. Товпеко Д.В., Калюжная Л.И., Чеботарёв С.В., Меньшиков Н.О. Децеллюляризация ткани пуповины человека как перспективный метод получения бесклеточного матрикса для регенеративной медицины и тканевой инженерии // Сборник тезисов VI Международной конференции молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов. Новосибирск : ИПЦ НГУ. 2019. Т. 4. С. 646-649. URL: https://www.openbio.ru/openbio_tezis_2019.pdf

14.    Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. Москва : Медиа Сфера, 2006, 312 с.

15.    Leung А., Crombleholme T.M., Keswani S.G. Fetal wound healing: implications for minimal scar formation // Curr. Opin. Pediatr. 2015. Vol. 24, N 3. P. 371-378.

16.    Toh W.S., Brittberg M., Farr J. et al. Cellular senescence in aging and osteoarthritis // Acta Orthop. 2016. Vol. 87. P. 6-14. DOI: https://doi.org/10.1080/17453674.2016.1235087

17.    Pawitan J.A. Prospect of stem cell conditioned medium in regenerative medicine // Biomed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. Article ID 965849.

18.    Koci Z., Vyborny K., Dubisova J. et al. Extracellular matrix hydrogel derived from human umbilical cord as a scaffold for neural tissue repair and its comparison with extracellular matrix from porcine tissues // Tissue Eng. Part C Methods. 2017. Vol. 23, N 6. P. 333-345. DOI: https://doi.org/10.1089/ten.tec.2017.0089

19.    Zhao P., Liu S., Bai Y. et al. hWJECM-derived oriented scaffolds with autologous chondrocytes for rabbit cartilage defect repairing // Tissue Eng. Part A. 2018.Vol. 24, N 11-12. P. 905-914. DOI: https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2017.0223

20.    Badylak S.F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response // Ann. Biomed. Eng. 2014. Vol. 42. P. 1517-1524. DOI: https://doi.org/10.1007/s10439-013-0963-7

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Дземешкевич Сергей Леонидович
Доктор медицинских наук, профессор (Москва, Россия)
Медицина сегодня
Конференция "Неотложные состояния в акушерстве"

Две профессии - сотни жизней Приглашаем Вас принять участие в работе V всероссийской научно-практической конференции "Неотложные состояния в акушерстве", которая состоится 26-27 апреля 2021 года под эгидой ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства,...

Современные технологии лечения витреоретинальной патологии

18-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Современные технологии лечения витреоретинальной патологии" 25-26 июня 2021 года Наука и практика офтальмологии сегодня развиваются стремительно. Появляются новые публикации, меняются подходы к...

IV Севастопольские онкологические чтения

Научно-практическая конференция "IV Севастопольские онкологические чтения" 1-2 апреля 2021 года Онкологические болезни остаются одной из наиболее актуальных проблем в медицинской науке. Множество исследований посвящено борьбе с ними и непрерывно ведется поиск более...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»