Влияние полимерного состава тканеинженерных сосудистых заплат, содержащих фактор роста эндотелия сосудов, на их свойства и ремоделирование in situ

Резюме

Актуальность. Каротидная эндартерэктомия с использованием заплаты - один из наиболее эффективных способов лечения стеноза сонной артерии. Однако применение существующих сосудистых заплат может быть ассоциировано с возникновением тромбоза, рестеноза, кальцификации и других осложнений. Значительные перспективы в качестве альтернативных материалов для ангиопластики демонстрируют тканеинженерные матриксы на основе биодеградируемых полимеров.

Цель исследования - сравнительная оценка заплат из поликапролактона (PCL) и смеси полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и PCL, модифицированных фактором роста эндотелия сосудов (VEGF).

Материал и методы. Заплаты с введенным ростовым фактором изготавливали методом эмульсионного электроспиннинга и оценивали их морфологию и механические свойства, агрегацию тромбоцитов, а также ремоделирование и кальцификацию после имплантаций в брюшную аорту крыс сроком до 12 мес с помощью гистологического и иммунофлуоресцентного исследований. 

Результаты. Инкорпорирование VEGF в полимерные волокна уменьшало жесткость PCL и PHBV/PCL и снижало агрегацию тромбоцитов при контакте с матриксами. Заплаты из PHBV/PCL/VEGF полностью эндотелизировались через 3 мес имплантации в сосудистую стенку, а PCL/VEGF образцы - только через 12 мес. В 50% PCL заплат с VEGF через 12 мес наблюдали гранулематозное воспаление с утолщением имплантата, а также обширные очаги кальция - во всех образцах. Заселение PHBV/PCL/VEGF образцов клетками не имело признаков хронического воспаления, а небольшие участки кальцификации отмечали через 12 мес в 66,7% случаев.

Заключение. Заплаты PHBV/PCL/VEGF обладают лучшей биосовместимостью и более пригодны для реконструкции сосудистой стенки по сравнению с PCL/VEGF.

Ключевые слова:сосудистая заплата, тканевая инженерия, полигидроксибутират/валерат, поликапролактон, фактор роста эндотелия сосудов, биодеградируемые полимеры, эндотелизация

Финансирование. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546-2019-0002 "Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов".
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Севостьянова В.В., Миронов А.В., Антонова Л.В., Кривкина Е.О., Матвеева В.Г., Великанова Е.А., Глушкова Т.В., Акентьева Т.Н., Барбараш Л.С. Влияние полимерного состава тканеинженерных сосудистых заплат, содержащих фактор роста эндотелия сосудов, на их свойства и ремоделирование in situ // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2021. Т. 9, № 3. С. 25-36. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-1198-2021-9-3-25-36

Каротидная эндартерэктомия (КЭА) - эффективное хирургическое лечение пациентов с выраженным стенозом внутренней сонной артерии (ВСА) с целью предотвращения инсульта [1]. В России смертность от цереброваскулярных заболеваний занимает 2-е место после ишемической болезни сердца, а количество человек, перенесших ишемический инсульт, ежегодно составляет около 500 тыс. [2]. КЭА выполняют путем продольного разреза стенки ВСА с последующим удалением атеросклеротической бляшки и закрытием разреза первичным швом или сосудистой заплатой [3]. Закрытие артериотомии первичным швом чаще ассоциировано с возникновением рестеноза по сравнению с использованием заплат [4]. Согласно рекомендациям Европейского общества сосудистых хирургов, КЭА с применением заплат снижает риск возникновения таких послеоперационных осложнений, как окклюзия и рестеноз ВГА, а также смерть в результате инсульта [4].

Наиболее подходящим материалом для ангиопластики ВСА является большая подкожная вена, так как она обладает всеми преимуществами аутологичной ткани [5]. Однако ее использование приводит к увеличению времени операции в результате необходимости дополнительного хирургического вмешательства, которое также может стать причиной осложнений в месте эксплантации вены. К альтернативным коммерчески доступным сосудистым заплатам относятся имплантаты из бычьего перикарда и синтетических полимеров: расширенного политетрафторэтилена (expanded polytetrafluoroethylene, ePTFE) и Dacron, состоящего из полиэфирных волокон [6]. Данные материалы обладают хорошими механическими свойствами, доступностью и удобством применения, однако использование искусственных заплат может быть ассоциировано с инфицированием и тромбозом, в то время ксеноперикард имеет высокий риск кальцификации [6, 7].

Современные достижения в разработке новых сосудистых имплантатов основываются главным образом на подходах тканевой инженерии, использующих биодеградируемые матриксы [8]. Тканеинженерные (ТИ) сосудистые заплаты помогут избежать проблем, возникающих при использовании существующих материалов, благодаря восстановлению тканей в месте имплантации. Для достижения такого результата биодеградируемый матрикс должен обладать высокой биосовместимостью, обеспечивать миграцию клеток в толщу материала, их пролиферацию и дифференцировку.

В ряде работ было показано, что большой потенциал в стимуляции эндотелизации и регенерации сосудистой стенки на основе ТИ матрикса имеет фактор роста эндотелия сосудов (VascuLar Endothelial Growth Factor, VEGF) [9-11]. Являясь основным ангиогенным фактором роста, VEGF управляет миграцией эндотелиальных клеток и стимулирует ангиогенез [12]. Кроме того, показана способность VEGF захватывать эндотелиальные прогениторные клетки из тока крови [13]. Многообещающие результаты с регенерацией стенки кровеносного сосуда in situ демонстрируют ТИ имплантаты с инкорпорированным VEGF на основе биосовместимых полимеров: поликапролактона [poly(ε-caprolactone), PCL] и смеси полигидрок-сибутирата/валерата [poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxy valerate), PHBV] и PCL [14, 15]. В свою очередь, настоящее исследование направлено на сравнение свойства заплат PCL/VEGF и PHBV/ PCL/VEGF и их эффективности при реконструкции сосудистой стенки.

Материал и методы

1.    Электроспиннинг заплат

Изготовление сосудистых заплат осуществляли методом электроспиннинга из 14% раствора PCL в трихлорметане или 15% раствора смеси PHBV и PCL (1:2) в трихлорметане при условиях, указанных в таблице. Для создания полимерных заплат, содержащих ростовой фактор, использовали метод эмульсионного электроспиннинга. Раствор PCL в трихлорметане (14%) или раствор смеси PHBV и PCL в трихлорметане (15%) смешивали с VEGF в физиологическом растворе (10 мкг/мл) в соотношении 20:1 до получения эмульсии. Все заплаты изготавливали на установке Nanon-01A (MECC, Япония).

Параметры проведения электроспиннинга полимерных заплат

Примечание. PCL - поликапролактон; PHBV - полигидроксибутират/валерат; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов.

Таким образом, было получено 4 вида заплат: PCL, PHBV/PCL, PCL/VEGF, PHBV/PCL/VEGF.

2.    Сканирующая электронная микроскопия

Морфологию заплат оценивали методом сканирующей электронной микроскопии. Предварительно на образцы PCL, PHBV/PCL, PCL/VEGF, PHBV/ PCL/VEGF наносили золото-палладиевое покрытие толщиной 7-9 нм с использованием системы напыления EM ACE200 (Leica Mikrosysteme GmbH, Австрия), после чего изучали на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 10 кВ в условиях высокого вакуума. Диаметр волокон полимерных материалов определяли с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health, США).

3.    Механические испытания

Образцы заплат PCL, PHBV/PCL, PCL/VEGF, PHBV/ PCL/VEGF подготавливали с использованием вырубного пресса ZCP 020 (Zwick/Roell, Германия) и ножа В083 в соответствии со стандартом ISO 37:2017. Испытания осуществляли с помощью машины серии Z (Zwick/Roell, Германия), оценивая предел прочности материалов, относительное удлинение до начала разрушения и модуль Юнга (Емод).

Внутреннюю грудную артерию человека и аорту крысы использовали в качестве контроля. Участки внутренней грудной артерии забирали при проведении аортокоронарного шунтирования у пациентов, подписавших договор информированного согласия на взятие материала.

4.    Агрегация тромбоцитов

Оценку агрегации тромбоцитов при контакте с немодифицированными и модифицированными PHBV/PCL и PCL заплатами осуществляли в соответствии со стандартом ISO 10993.4. В свежую донорскую кровь добавляли 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали путем центрифугирования цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 мин. Интактную ОТП использовали в качестве положительного контроля. Для калибровки прибора применяли бедную тромбоцитами плазму, полученную повторным центрифугированием ОТП при 4000 об/мин в течение 20 мин.

Измерения проводили в спонтанном режиме без использования индукторов агрегации. Перед измерением уровень ионов кальция в цитратной крови восстанавливали добавлением 0,025 М раствора хлорида кальция. Для этого в 250 мкл ОТП вносили 25 мкл раствора хлорида кальция и выдерживали 3 мин [16, 17]. После чего определяли максимум агрегации тромбоцитов с помощью полуавтоматического 4-канального анализатора АРАСТ 4004 (LABiTec, Германия).

5.    Ангиопластика аорты крыс

Исследование in vivo полимерных заплат, содержащих ростовой фактор, осуществляли путем закрытия аортотомии у крыс. Все процедуры осуществляли, соблюдая принципы гуманного обращения с животными, регламентированные требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986). Работа одобрена локальным этическим комитетом ФГБНУ "НИИ КПССЗ" (протокол № 15 от 11.09.2018). Самцов крыс популяции Wistar массой 400-450 г (n=48) вводили в наркоз ингаляцией 3% изофлурана, во время операции животные получали наркоз 1,5% изофлурана. Образцы заплат из PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF размером 0,5х0,5 мм, предварительно стерилизованные γ-излучением, имплантировали в разрез на стенке брюшной аорты узловыми швами с использованием нити Prolene 8/0. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания. Вывод крыс из эксперимента осуществляли через 1, 3, 6 и 12 мес после имплантации с помощью внутрибрюшного введения пентобарбитала натрия (100 мг/кг массы тела).

Полученные образцы заплат вместе с прилежащими участками аорты делили на две части, одну из которых помещали в 10% забуференный формалин (BioVitrum, Россия), а вторую подвергали заморозке при -140 °C.

6. Гистологическое исследование

Фиксированные в забуференном формалине образцы использовали для осуществления гистологического исследования с окраской гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, а также ализариновым красным С. Для этого образцы помещали на 2 ч под проточную воду, далее проводили обезвоживание в изопропаноле 5-кратно по 30 мин, заключали в парафин при 56 °С и изготавливали срезы толщиной 8 мкм с применением микротома (Microm HM 325, Thermo Scientific, США). Высушенные при 37 °С срезы депарафинизировали в ксилоле трижды по 5 мин и обезвоживали в 95% этаноле 3 раза по 5 мин.

Для окрашивания гематоксилином и эозином депарафинизированные срезы дважды промывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Харриса (BioVitrum) в течение 5 мин с последующим 2-кратным погружением в дистиллированную воду и промывали проточной водопроводной водой в течение 5 мин. Затем срезы погружали в 1% раствор HCl в 70% этаноле на 2 с, после чего помещали под проточную водопроводную воду на 30 мин, дважды промывали дистиллированной водой и окрашивали эозином (BioVitrum) в течение 30 с. Далее образцы дважды промывали дистиллированной водой и обезвоживали в возрастающих концентрациях этанола (70% - 10 с, 95% - 10 с и 95% - 1 мин), очищали ксилолом в течение 3 мин.

Для окрашивания по Ван Гизону депарафинизированные срезы погружали в 95% этанол 3 раза по 5 мин, промывали дважды дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Вейгерта (BioVitrum) в течение 10 мин. После отмывания образцов проточной водопроводной водой в течение 3 мин их погружали в дифференцирующий раствор (1% HCl в 70% этаноле) на 2 с, а затем снова под проточную водопроводную воду на 30 мин, дважды промывали дистиллированной водой и окрашивали пикрофуксином (BioVitrum) в течение 2,5 мин с последующим 2-кратным промыванием в дистиллированной воде. Срезы обезвоживали с использованием возрастающих концентрациях этанола (70% - 10 с, 95% - 10 с и 95% - 1 мин) и очищали ксилолом в течение 3 мин.

Для оценки наличия кальция срезы окрашивали ализариновым красным С (ХимСервис, Россия). Срезы погружали в 2% водный раствор ализаринового красного С на 70 с и затем дважды промывали дистиллированной водой и высушивали. Все образцы исследовали с использованием светового микроскопа AxioImager.A1 (Carl Zeiss, Германия).

7.    Иммунофлуоресцентное окрашивание

Для оценки эндотелизации внутренней поверхности заплат проводили окрашивание на CD31, CD34 и фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor, vWF), формирование внеклеточного матрикса изучали окраской на коллаген IV типа. На криотоме Microm HM 525 (Thermo Scientific) изготавливали срезы толщиной 8 мкм, которые окрашивали с применением специфических первичных антител мыши к CD31 крысы (ab119339, Abcam) и антител кролика к CD34 крысы (ab185732, Abcam), или антител к vWF, конъюгированных с FITC (ab8822, Abcam), или антител кролика к коллагену IV типа (ab6586, Abcam). На образцы с антителами к CD31 и CD34, а также к коллагену IV типа наносили смесь вторичных антител козы к Ig мыши, конъюгированных с AlexaFluor568 (ab175473, Abcam), и антител осла к Ig кролика, конъюгированных с AlexaFluor488 (ab150105, Abcam). Все срезы докрашивали ядерным красителем DAPI (Sigma-aldrich, США). Исследование препаратов осуществляли на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 700 (Carl Zeiss).

8.    Статистическая обработка данных

Анализ полученных данных проводили с помощью Prism (Graph Pad Software). Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова-Смирнова. При сравнении двух независимых групп использовали критерий Манна-Уитни. При сравнении трех и более независимых групп применяли непараметрический критерий Краскела-Уоллиса, при попарном сравнении групп использовали критерий Данна. Достоверными считали различия при уровне значимости p<0,05. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение, а также медианы и 25-го и 75-го процентиля Me (25%; 75%).

Результаты

Структурные особенности заплат

Сканирующая электронная микроскопия поверхности полимерных заплат показала, что все образцы, как немодифицированные, так и содержащие VEGF, имели высокопористую структуру и состояли из микроразмерных разнонаправленных волокон (рис. 1). Диаметр волокон PCL с VEGF составил 1,50±0,22 мкм и был меньше данного показателя для немодифицированного PCL -2,06±0,69 мкм (p<0,05). Такую же закономерность отмечали и для материала PHBV/PCL/VEGF с диаметром волокон 1,47±0,67 мкм относительно PHBV/ PCL - 2,64±1,14 мкм (p<0,05). При этом не отмечали различий по структуре и размеру волокон между PCL и PHBV/PCL, а также между PCL/VEGF и PHBV/ PCL/VEGF.

Рис. 1. Морфология внутренней поверхности сосудистых заплат из PCL, PCL/VEGF, PHBV/PCL и PHBV/PCL/ VEGF. Сканирующая электронная микроскопия, увеличение х500

Fig. 1. Inner surface morphology of vascular patches from PCL, PCL / VEGF, PHBV / PCL and PHBV / PCL / VEGF. Scanning electron microscopy, magnification х500

Влияние состава заплат на их механические свойства

Не отмечали статистически значимых различий по прочности между полимерными заплатами и нативными сосудами, a. mammaria аорты крысы (рис. 2). При модификации VEGF происходило снижение прочностных свойств заплат, как для PCL, так и для PCL/PHBV (р<0,05). Снижение относительного удлинения в 8,47 раза (р<0,05) наблюдали для PCL-графтов после модификации. Емод для PCL и PHBV/ PCL составил 18,15 (17,33; 18,3) и 21,8 (18,95; 25,78) МПа соответственно. Введение ростового фактора в полимерные заплаты приводило к уменьшению жесткости материалов до 13,4 (13,05;14,05) МПа для PCL/VEGF и до 16,6 (15,48; 17,33) МПа, однако эти изменения были статистически недостоверными и не достигали значений Емод для нативных сосудов: a mammaria - 2,42 (1,87; 3,19) МПа, крысиной аорты - 0,19 (0,17; 0,21) МПа. Различий по механическим свойствам между заплатами PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF не отмечали.

Рис. 2. Механические свойства сосудистых заплат из PCL, PCL/VEGF, PHBV/PCL, PHBV/PCL/VEGF и нативных кровеносных сосудов, a. mammaria и аорты крысы (АК): A - предел прочности; Б - относительное удлинение; В - модуль Юнга (Емод); Г - кривая "предел прочности - деформация"

Fig. 2. Mechanical properties of vascular patches from PCL, PCL/VEGF, PHBV/PCL, PHBV/PCL/VEGF and native blood vessels, a.mammaria and rat aorta (AK): A - tensile strength; B - elongation; C - Young's modulus (Emod); D - "Tensile strengthstrain" curve

Агрегация тромбоцитов

Результаты проведенного исследования показали, что агрегационная активность тромбоцитов при контакте PHBV/PCL-заплатами превышала данный показатель интактной ОТП (p<0,05) (рис. 3). При этом не отмечали существенных различий между PCL и интактной ОТП. Степень агрегации тромбоцитов после контакта с образцами PCL/VEGF 86,15 (81,53; 88,08)% была незначительно ниже, чем при контакте с немодифицированным PCL 87,23 (82,04; 91,27)%. Статистически значимое снижение максимума агрегации наблюдали для PHBV/PCL/VEGF 81,35 (72,10; 89,02)% относительно PHBV/PCL, не содержащих ростовой фактор, 87,23 (83,79; 89,89)% (p<0,05).

Рис. 3. Максимум агрегации тромбоцитов для сосудистых заплат из PCL, PCL/VEGF, PHBV/PCL, PHBV/PCL/ VEGF. Интактная ОТП - интактная обогащенная тромбоцитами плазма

Fig. 3. Maximum platelet aggregation for vascular patches from PCL, PCL/ VEGF, PHBV/PCL, PHBV/ PCL/VEGF. Intact PRP - intact plateletrich plasma

Особенности ремоделирования заплат PCL и PHBV/PCL, модифицированных VEGF, in situ

Заплаты из PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF демонстрировали удобство в имплантации. На протяжении всего эксперимента не отмечали кровотечений и нарушений целостности имплантатов. Одно животное с имплантированной заплатой PCL/VEGF погибло спустя 11,5 мес. Причиной смерти стал обтурирующий тромб аорты в зоне локации заплаты. Формирование пристеночного тромба в месте имплантации заплаты наблюдали только в 1 случае в группе PHBV/PCL/VEGF через 1 мес, при этом сохранялась проходимость сосуда. У всех остальных животных в обеих группах исследования тромбообразования не выявлено.

В процессе ремоделирования на внутренней поверхности заплат формировалась неоинтима (рис. 4). В 1 из образцов PCL/VEGF через 6 мес неоинтима достигала толщины заплаты, а через 12 мес - в 3 из 6, при этом стеноза аорты не отмечали. В свою очередь, на заплатах PHBV/PCL/VEGF неоинтимальная выстилка имела небольшую толщину во все сроки наблюдения.

Рис. 4. Формирование неоинтимы и эндотелиального слоя на внутренней поверхности заплат PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF после имплантации в стенку брюшной аорты крыс на 1, 3, 6 и 12 мес. Гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином (ГЭ), увеличение ×50. Иммунофлуоресцентное исследование на маркеры эндотелиальных клеток: двойное окрашивание CD31 (красный) и CD34 (зеленый), увеличение ×200; vWF - фактор фон Виллебранда (зеленый), увеличение ×200

Fig. 4. Formation of the neointima and endothelial, layer on the inner surface of PCL/VEGF and PHBV/PCL/VEGF patches after implantation into the abdominal aorta wall of rats at 1, 3, 6 and 12 months. Histological examination with hematoxylin and eosin staining, magnification х50. Immunofluorescence analysis of endothelial cell markers: CD31 (red) and CD34 (green) costaining, magnification х200; vWF - von Willebrand factor (green), magnification х200

Эндотелизацию внутренней поверхности заплат оценивали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител к маркерам эндотелиальных клеток: CD34, CD31 и vWF (рис. 4). В обоих типах заплат через 1 мес наблюдали единичные CD34+/CD31+-клетки в зонах анастомоза. Спустя 3 мес имплантации на внутренней поверхности PHBV/PCL/VEGF заплат формировался монослой зрелых эндотелиальных клеток CD34/CD31+, который сохранялся на протяжении всего эксперимента. При этом на образцах PCL/VEGF эндотелиальный слой отмечали только через 12 мес.

Миграция макрофагов и фибробластов из окружающих тканей в толщу заплат из PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF обеспечивало их заселение клетками, которое сопровождалось формированием внеклеточного матрикса, содержащего коллаген IV типа, и васкуляризацией (рис. 5). Высокая клеточность наблюдалась в заплатах обоих типов через 3 мес исследования. Однако во все месяцы имплантации количество клеток в образцах из PCL/VEGF было больше по сравнению с PHBV/PCL/VEGF. А к 12-му месяцу наблюдения в половине изделий из PCL с ростовым фактором отмечали скопления гигантских многоядерных клеток инородных тел и начало гранулематозного воспаления, что приводило к утолщению заплат.

Рис. 5. Заселение клетками и формирование внеклеточного матрикса в заплатах PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF после имплантации в стенку брюшной аорты крыс на 1, 3, 6 и 12 мес. Гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином (ГЭ), увеличение ×200; с окраской по Ван Гизону (ВГ), увеличение ×200.  Иммунофлуоресцентное исследование с окраской на коллаген IV типа (зеленый), увеличение ×200

Fig. 5. Cell colonization and formation of the extracellular matrix in PCL/VEGF and PHBV/PCL/VEGF patches after implantation into the abdominal aortic wall of rats at 1, 3, 6 and 12 months. Histological examination with hematoxylin and eosin staining, magnification х200; with Van Gieson staining, magnification х200. Immunofluorescence analysis of collagen type IV (green), magnification х200

Гистологическое исследование с окраской ализариновым красным С показало, что отложение кальция в имплантатах обоих групп начиналось через 3 мес (рис. б). При этом небольшие очаги кальция наблюдали вокруг шовного материала в зоне анастомозов, а также в неоинтиме. Через 12 мес во всех заплатах PCL/VEGF обнаружены крупные протяженные участки кристаллического кальция, локализующиеся преимущественно под неоинтимой. В то же время в группе PHBV/PCL/VEGF отмечали отдельные небольшие очаги кальцификации в 66,7% заплат, преимущественно вокруг шовного материала.

Рис. 6. Кальцификация заплат PCL/VEGF и PHBV/PCL/VEGF после имплантации в стенку брюшной аорты крыс на 1, 3, 6 и 12 мес. Гистологическое исследование с окраской ализариновым красным С (красный), увеличение х100


Fig. 6. Calcification of PCL/ VEGF and PHBV/PCL/VEGF patches after implantation into the abdominal aortic watt of rats at 1, 3, 6 and 12 months. Histological examination with alizarin red C staining (red), magnification х100

Обсуждение

Известно, что высокая пористость тканеинженерного матрикса и наноразмерные волокна в его структуре обеспечивают клеточную миграцию внутрь материала и его заселение клетками, а также способствуют эндотелизации сосудистых имплантатов [18]. Это обусловлено структурной схожестью искусственного и нативного матриксов. Тонкие полимерные волокна обеспечивают большую площадь взаимодействия клеток и искусственного матрикса, что способствует лучшей клеточной адгезии и миграции. В свою очередь, эффективная инфильтрация клеток в толщу пористого материала способствует его лучшей интеграции с нативными тканями в месте имплантации. Полимерные заплаты PCL и PHBV/PCL с инкорпорированными VEGF имели высокопористую структуру и состояли из волокон меньшего диметра по сравнению с немодифицированными образцами. Снижение диаметра волокон при введении ростового фактора в полимер обусловлено их значительным вытяжением при проведении эмульсионного электроспиннинга в результате отталкивания заряженных молекул водного раствора друг от друга. Таким образом, морфология заплат PCL/VEGF и PHBV/PCL/ VEGF имела большее сходство с нативным внеклеточным матриксом, чем структура изделий из PCL и PHBV/PCL.

Механические свойства полимерных заплат отличались от свойств нативных кровеносных сосудов, что обусловлено отсутствием коллагена, эластина и гликозаминогликанов в составе имплантатов [19]. Образцы PCL и PHBV/PCL обладали высокой жесткостью и отвечали на нагружение повышением напряжения без значительного удлинения. В свою очередь, нативный материал удлиняется без существенного увеличения напряжения, что характеризуется низким значением Емод Инкорпорирование VEGF способствовало снижению жесткости материала. Более того, ремоделирование имплантированных заплат in vivo с заселением клетками, синтезирующими внеклеточный матрикс, должно способствовать изменению механических свойств имплантатов с сторону показателей нативных сосудов, снижению негативного влияния на гидродинамику в реконструированном сосуде [20].

Для изготовления сосудистых имплантатов важным показателем является гемосовместимость материала [21]. Ключевую роль в формировании тромба играет агрегация тромбоцитов. Проведенные in vitro исследования продемонстрировали, что степень агрегации тромбоцитов при контакте с немодифицированными PHBV/PCL-образцами превышала значения для интактной ОТП. При этом введение VEGF в PHBV/PCL способствовало снижению данного показателя. Кроме того, ранее нами было показано, что показатель максимума агрегации тромбоцитов для сосудистых заплат на основе PHBV/PCL значительно ниже, чем для коммерческих заплат из бычьего перикарда КемПериплас-Нео (ЗАО "НеоКор", Россия), используемых при проведении КЭА [22].

Частыми осложнениями при использовании синтетических заплат для реконструкции стенки артерии при проведении КЭА являются тромбоз и гиперплазия неоинтимы, которые приводят к нарушению проходимости сосуда [6]. Причина данных осложнений заключается в медленном кровотоке в сосудах малого диаметра. Быстрое формирование эндотелиального слоя на внутренней поверхности заплат может способствовать сохранению проходимости сосуда на более поздних сроках. В настоящем исследовании сосуды, протезированые как PCL/VEGF, так и PHBV/PCL/VEGF, характеризовались высокой проходимостью и отсутствием гиперплазии неоинтимы.

На сегодняшний день показано, что VEGF, введенный в сосудистые имплантаты, привлекает эндотелиальные клетки на их поверхность [9, 13]. Так, образование эндотелиального слоя происходило на внутренней поверхности обоих типов исследуемых заплат. Однако зрелый эндотелий в графтах PHBV/PCL/VEGF полностью формировался через 3 мес, в то время как на PCL/VEGF - только через 12 мес. Это может быть связано с высокой биосовместимостью PHBV, которая, в свою очередь, способствует адгезии клеток и их выживаемости [23].

Ремоделирование заплат сопровождалось их заселением клетками с формированием внеклеточного матрикса. При этом активная инфильтрация PCL/VEGF-имплантатов макрофагами, наблюдаемая на протяжении всего исследования, на более поздних сроках приводила к гранулематозному воспалению и утолщению заплат. Причина, вероятно, также в высокой биосовместимости PHBV по сравнению с PCL, и слишком медленная деградация второго. По данным литературы, полная деградация PCL происходит в течение 3-4 лет [24]. В свою очередь, персистирующая воспалительная реакция, сопровождающаяся образованием грануляционной ткани, приводит к утолщению имплантата, а впоследствии и к фиброзу [25].

Более того, известно, что макрофаги с провоспалительным фенотипом М1 участвуют в ранней фазе кальцификации, высвобождая внеклеточные везикулы, содержащие комплекс фосфатидил-серин-аннексин V-S100A9, который способствует образованию зародышей кристаллов кальция [26]. Вероятно, это обусловливает более обширную кальцификацию образцов PCL/VEGF. Однако вопрос кальцификации сердечно-сосудистых имплантатов довольно сложный и на сегодняшний день не имеет однозначно ответа.

Заключение

Проведенное исследование показало, что ТИ заплаты, содержащие в составе PHBV, характеризовались наибольшей жесткостью среди всех изучаемых в работе полимерных и биологических материалов. При этом VEGF-модификация PCL и PHBV/PCL способствовала снижению их жесткости, а также улучшала гемосовместимость полимерных образцов. В эксперименте in vivo сосудистые заплаты PHBV/PCL/VEGF демонстрировали более быструю эндотелизацию, заселение клетками без гранулематозного воспаления и меньшую склонность к кальцификации по сравнению с заплатами PCL/VEGF, что, вероятно, обусловлено высокой биосовместимостью PHBV. Таким образом, материал PHBV/PCL/VEGF, изготовленный эмульсионным электроспиннингом, имеет большой потенциал для создания на его основе сосудистых заплат для клинического применения.

Литература

1.    Oldenburg W.A., Almerey T., Selim M., Farres H., Hakaim A.G. Durability of carotid endarterectomy with bovine pericardial patch // Ann. Vasc. Surg. 2018. Vol. 50. P. 218224. DOI: https://doi.org/10.1016/j.avsg.2017.11.062

2. Гавриленко А.В., Куклин А.В., Фомина В.В. Классическая и эверсионная каротидная эндартерэктомия у пациентов со стенозом внутренней сонной артерии // Хирургия. Журнал имени Н.И. Пирогова. 2018. № 2. С. 87-92. DOI: https://doi.org/10.17116/hirurgia2018287-92

3.    Huizing E., Vos C.G., Hulsebos R.G., van den Akker P.J., Borst G.J., UnlU Q. Patch angioplasty or primary closure following carotid endarterectomy for symptomatic carotid artery stenosis // Surg. J. (N.Y.). 2018. Vol. 4, N 2. P. e96-e101. DOI: https://doi.org/10.1055/s-0038-1655757

4.    Naylor A.R., Ricco J.B., de Borst G.J., Debus S., de Haro J., Halliday A. et al. Editor’s choice e management of atherosclerotic carotid and vertebral artery disease: 2017 clinical practice guidelines of the European Society for Vascular Surgery (ESVS) // Eur. J. Vasc. Endo-vasc. Surg. 2018. Vol. 55. P. 3-81. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejvs.2017.06.021

5. Яриков А.В., Балябин А.В., Яшин К.С., Мухин А.С. Хирургические методы лечения стеноза сонных артерий (обзор) // Современные технологии в медицине. 2015. Т. 7, № 4. С. 189-200.  DOI: https://doi.org/10.17691/stm2015.7.4.25

6.    Ren S., Li X., Wen J., Zhang W., Liu P. Systematic review of randomized controlled trials of different types of patch materials during carotid endarterectomy // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 1. Article ID e55050. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055050

7.    Saporito W.F., Pires A.C., Cardoso S.H., Correa J.A., de Abreu L.C., Valenti V.E. et al. Bovine pericardium retail preserved in glutaraldehyde and used as a vascular patch // BMC Surg. 2011. Vol. 11. P. 37. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2482-11-37

8.    Kim C.-W., Kim M.-K., Kim S.-G., Park Y.-W., Park Y.-T., Kim D.-W. et al. Angioplasty using 4-hexylresor-cinol-incorporated silk vascular patch in rat carotid defect model // Appl. Sci. 2018. Vol. 8. P. 2388. DOI: https://doi.org/10.3390/app8122388.8

9.    Smith R.J., Yi T., Nasiri B., Breuer C.K., Andrea-dis S.T. Implantation of VEGF-functionalized cell-free vascular grafts: regenerative and immunological response // FASEB J. 2019. Vol. 3, N 4. P. 5089-5100. DOI: https://doi.org/10.1096/fj.201801856R

10.    Shin Y.M., Lee Y.B., Kim S.J., Kang J.K., Park J.C., Jang W. et al. Mussel-inspired immobilization of vascular endothelial growth factor (VEGF) for enhanced endo-thelialization of vascular grafts // Biomacromolecules. 2012. Vol. 13, N 7. P. 2020-2028. DOI: https://doi.org/10.1021/bm300194b

11. Antonova L.V., Sevostyanova V.V., Mironov A.V., Krivkina E.O., Velikanova E.A., Matveeva V.G. et al. In situ vascular tissue remodeling using biodegradable tubular scaffolds with incorporated growth factors and chemoattractant molecules // Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2018. Vol. 7, N 2. P. 25-36. DOI: https://doi.org/10.17802/2306-1278-2018-7-2-25-36

12.    Krilleke D., Ng Y.S.E., Shima D.T. The heparinbinding domain confers diverse functions of VEGF-A in development and disease: a structure-function study // Biochem. Soc. Trans. 2009. Vol. 37. P. 1201-1206. DOI: https://doi.org/10.1042/BST0371201.13

13.    Miyazu K., Kawahara D., Ohtake H., Watanabe G., Matsuda T. Luminal surface design of electrospun small-diameter graft aiming at in situ capture of endothelial progenitor cell // J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomat. 2010. Vol. 94, N 1. P. 53-63. DOI: https://doi.org/10.1002/jbm.b.31623

14. Sevostianova V.V., Mironov A.V., Krivkina E.O., Khanova M.V., Velikanova E.A., Matveeva V.G. et al. Biodegradable poly(s-caprolactone) VEGF-containing vascular patches for angioplasty // AIP Conference Proceedings. 2019. Vol. 2167. Article ID 020321. DOI: https://doi.org/10.1063/1.5132188

15. Севостьянова В.В., Миронов А.В., Антонова Л.В., Кривкина Е.О., Матвеева В.Г., Великанова Е.Аи дрТканеинженерная заплата, модифицированная фактором роста эндотелия сосудов, для реконструкции сосудистой стенки // Патология кровообращения и кардиохирургия. 2020. Т. 24, № 4. С. 114-128. DOI: https://doi.org/10.21688/1681-3472-2020-4-114-128

16.    Arimura S., Kawahara K., Biswas K.K., Abeya-ma K., Tabata M., Shimoda T. et al. Hydroxyapatite formed on/in agarose gel induces activation of blood coagulation and platelets aggregation // J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. 2007. Vol. 81, N 2. P. 456-461. DOI: https://doi.org/10.1002/jbm.b.30684

17.    Shen X., Su F., Dong J., Fan Z., Duan Y., Li S. In vitro biocompatibility evaluation of bioresorbable copolymers prepared from l-lactide, 1, 3-trimethylene carbonate, and glycolide for cardiovascular applications // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2015. Vol. 26, N 8. P. 497-514. DOI: https://doi.org/10.1080/09205063.2015.1030992

18.    Catto V., Fare S., Freddi G., Tanzi M.C. Vascular tissue engineering: recent advances in small diameter blood vessel regeneration // ISRN Vasc. Med. 2014. Vol. 2014. Article ID 923030. DOI: https://doi.org/10.1155/2014/923030

19.    Singh C., Wong C.S., Wang X. Medical textiles as vascular implants and their success to mimic natural arteries // J. Funct. Biomater. 2015. Vol. 6, N 3. P. 500525. DOI: https://doi.org/10.3390/jfb6030500

20. Глушкова ТВ., Севостьянова В.В., Антонова Л.В., Клышников К.Ю., Овчаренко Е.А., Сергеева Е.Аи дрБиомеханическое ремоделирование биодеградируемых сосудистых графтов малого диаметра in situ // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2016. Т. 18, № 2. С. 99109. DOI: https://doi.org/10.15825/1995-1191-2016-2-99-109

21.    Muto A., Nishibe T., Dardik H., Dardik A. Patches for carotid artery endarterectomy: Current materials and prospects // J. Vasc. Surg. 2009. Vol. 50. P. 206-213. DOI: https://doi.org/10.1016/jjvs.2009.01.062

22. Sevostianova V.V., Antonova L.V., Mironov A.V., Yuzhalin A.E., Silnikov V.N., Glushkova T.V. et al. Biodegradable patches for arterial reconstruction modified with RGD peptides: results of an experimental study // ACS Omega. 2020. Vol. 5, N 34. P. 21 700-21 711. DOI: https://doi.org/10.1021/acsomega.0c02593

23.    Tebaldi M.L., Maia A.L.C., Poletto F., Andrade F., Soares D.C.F. Poly(-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyval-erate) (PHBV): Current advances in synthesis methodologies, antitumor applications and biocompatibility // J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2019. Vol. 51. P. 115-126. DOI: https://doi.org/10.1016/jjddst.2019.02.007

24.    Abedalwafa M., Wang F., Wang L., Li C. Biodegradable poly-epsilon-caprolactone (PCL) for tissue engineering applications: a review // Rev. Adv. Mater. Sci. 2013. Vol. 34. P. 123-140.

25. Должиков А.А., Колпаков А.Я., Ярош А.Л., Молчанова А.С., Должикова И.Н. Гигантские клетки инородных тел и тканевые реакции на поверхности имплантатов // Человек и его здоровье. 2017. № 3. С. 86-94. DOI: https://doi.org/10.21626/vestnik/2017-3/15

26. New S.E., Goettsch C., Aikawa M., Marchini J.F., Shibasaki M., Yabusaki K. et al. Macrophage-derived matrix vesicles: an alternative novel mechanism for microcalcification in atherosclerotic plaques // Circ. Res. 2013. Vol. 113. P 72-77. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.113.301036

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Дземешкевич Сергей Леонидович
Доктор медицинских наук, профессор (Москва, Россия)
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Конференция "Молекулярная диагностика"

Уважаемые коллеги ! Приглашаем Вас принять участие в X Юбилейной конференции "Молекулярная диагностика", которая пройдёт 9-11 ноября 2021 г. в Москве в ГК "Космос" (Проспект Мира, 150). На сегодняшний день согласно приказу Мэра Москвы с 8 ноября все массовые мероприятия с...

III Конгресс "Психическое здоровье человека XXI века"

ДЕТИ. ОБЩЕСТВО. БУДУЩЕЕ. III Конгресс "Психическое здоровье человека XXI века" Более 10 тысяч медицинских и немедицинских специалистов в сфере охраны психического здоровья, а также представителей социально-ориентированных НКО, деловых кругов, СМИ из 37 стран стали...

II Национальный междисциплинарный конгресс "Времена года. Женское здоровье от юного до серебряного и золотого возраста".

Пресс-релиз 21 и 22 октября 2021 года состоится II Национальный междисциплинарный конгресс "Времена года. Женское здоровье от юного до серебряного и золотого возраста" . Конгресс будет посвящен 20-летию Российской Ассоциации Маммологов и 15-летию первой кафедры клинической...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»