Сравнительные результаты бактериального исследования перитонеального экссудата при вторичном распространенном перитоните

Резюме

Важную роль в определении тактики лечения пациентов с вторичным распространенным перитонитом играет идентификация микроорганизмов - возбудителей инфекции. Бактериологический метод исследования является "золотым стандартом" поиска этиопатогенов, однако он занимает длительное время и имеет низкую чувствительность.

Цель - изучить возможности исследования микробного состава перитонеального экссудата методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) при вторичном распространенном перитоните в сравнении с традиционным бактериологическим исследованием.

Материал и методы. Изучены особенности микробного состава перитонеального экссудата у 42 пациентов, находившихся на лечении в хирургическом отделении ГАУЗ ПК "ГКБ № 4" (г. Пермь), в период май-декабрь 2019 г. по поводу вторичного распространенного перитонита различного генеза. Экссудаты исследованы методами бактериологического высева и ГХ-МС. 

Результаты. По данным бактериологического исследования положительными были 24 (57,14%) пробы перитонеального экссудата. Всего идентифицировано 33 бактериальные культуры, наиболее распространенными были энтеробактерии (23; 69,69%), неферментирующие грамотрицательные бактерии (6; 18,18%). По данным ГХ-МС, во всех исследованных экссудатах детектированы следы присутствия микроорганизмов. Анализ видового состава позволил определить представителей 24 родов, относящихся к 4 крупным филумам: Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria и Bacteroidetes. Большинство из них являлись минорными ассоциантами полимикробного консорциума.

Заключение. Диагностика этиопатогенов осложненной абдоминальной хирургической инфекции методом ГХ-МС более быстрая, чувствительная и универсальная. Недостатки метода - невозможность дифференцировать живые и нежизнеспособные микроорганизмы, оценить их антибиотикочувствительность.

Ключевые слова:вторичный перитонит, распространенный перитонит, микроорганизмы, бактериологическое исследование, газовая хроматография - масс-спектрометрия

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. 
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Самарцев В.А., Кузнецова М.П., Гаврилов В.А., Пушкарев Б.С., Масленникова И.Л., Кузнецова М.В. Сравнительные результаты бактериального исследования перитонеального экссудата при вторичном распространенном перитоните // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского. 2021. Т. 9, № 4. С. 111-117. DOI: https://doi.org/10.33029/2308-1198-2021-9-4-111-117

Вторичный распространенный перитонит (ВРП) представляет собой осложнение острых хирургических заболеваний органов брюшной полости и развивается в результате деструкции или перфорации различных отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) либо в послеоперационном периоде в результате несостоятельности анастомозов [1]. Во всем мире ВРП признан наиболее частой формой осложненной интраабдоминальной инфекции [2].

По данным современных клинических рекомендаций по лечению осложненных интраабдоминальных инфекций, одним из ключевых факторов успешного лечения ВРП, помимо своевременного и эффективного оперативного вмешательства, является адекватная антибактериальная терапия с учетом идентифицированного этиопатогена [3].

В настоящее время бактериологический метод является "золотым стандартом" в лабораторной диагностике большинства инфекционных заболеваний и их осложнений. Однако традиционное выделение из клинического материала чистой культуры этиопатогена и его последующая идентификация, как правило, занимают несколько дней. Кроме того, метод имеет низкую чувствительность [4]. Современные молекулярные методы, в частности газовая хроматография - масс-спектрометрия (ГХ-МС), основаны на выделении и анализе нуклеиновых кислот (в основном ДНК) или маркеров клеточной стенки (жирных кислот, альдегидов, спиртов и т.д.) из различных образцов патологического материала пациентов без культивирования микроорганизмов [5-7]. Подобный подход отличают быстрота и точность детекции возбудителей, что может способствовать ранней диагностике и оптимизации тактики лечения ВРП различного генеза. Сегодня метод ГХ-МС рутинно в диагностике интраабдоминальной инфекции не применяется.

Цель исследования - изучить возможности исследования микробного состава перитонеального экссудата методом ГХ-МС при ВРП в сравнении с традиционным бактериологическим исследованием.

Материал и методы

Проведено исследование экссудата брюшной полости пациентов с ВРП различного генеза (n=42), находившихся на лечении в хирургическом отделении ГАУЗ ПК "ГКБ № 4" (г. Пермь) с мая по декабрь 2019 г., методами прямого высева и ГХ-МС.

Группа имела следующие гендерные характеристики: 23 (54,76%) мужчины, 19 (45,24%) женщин. Возраст пациентов варьировал от 15 до 87 лет, медиана составила 50,00 (35,00; 69,75) лет. Медиана обращения пациентов от начала заболевания до оперативного вмешательства составила 24,00 (15,75; 48,00) ч. Перечень нозологических форм заболеваний, идентифицированных как источник вторичного распространенного перитонита, представлен в табл. 1.

Таблица 1. Перечень нозологических форм заболеваний, идентифицированных как источник вторичного распространенного перитонита (n=42)

После установления диагноза все пациенты были оперированы в экстренном порядке в объеме идентификации и контроля источника ВРП, санации и дренирования брюшной полости. Спектр оперативных вмешательств представлен в табл. 2.

Таблица 2. Спектр оперативных вмешательств у пациентов с вторичным распространенным перитонитом (n=42)

Этапу эвакуации экссудата из брюшной полости предшествовал забор его проб одновременно двумя способами - стерильным тампоном в пробирку с транспортной питательной средой для дальнейшего бактериологического исследования и стерильным шприцем в пробирку эппендорф для последующего исследования методом ГХ-МС. Идентификацию выделенных микроорганизмов бактериологическим методом осуществляли согласно приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1985, исследование проб экссудата методом ГХ-МС осуществляли по Н.В. Верховцевой, Г.А. Осипову [8], с использованием системы Agilent 6890/5973N (Agilent, США).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Jamovi (версия 1.6.23). Полученные количественные данные были проверены на нормальность распределения при помощи критерия Шапиро-Уилка. При отсутствии нормального распределения количественные данные описывали при помощи медианы, 1-го и 3-го квартилей. Номинальные данные описывали путем расчета абсолютных значений и процентных долей. Для оценки различий состава перитонеального экссудата у пациентов различного пола и возраста анализ проведен методом ординаций при помощи многомерного неметрического шкалирования.

Результаты

По данным бактериологического исследования из 42 клинических проб экссудата брюшной полости c положительным высевом были 24 (57,14%). В моноварианте возбудитель был обнаружен в 16 пробах, в ассоциации - в 8 пробах. При этом 2-вариантные ассоциации встречались в 7 случаях, 3-вариантные - только в 1 случае. Всего было идентифицировано 33 бактериальные культуры, представленные следующими микроорганизмами: E. coli - 12 (57,14%), Proteus spp. - 6 (18,18%), K. pneumoniae - 5 (15,15%), P. aeruginosa -4 (12,12%), Candida spp. - 3 (9,10%), A. baumanii - 2 (6,06%), S. epidermidis - 1 (3,03%). Таким образом, доля энтеробактерий составила 23 (69,69%), неферментирующих грамотрицательных бактерий - 6 (18,18%).

По данным ГХ-МС, в отличие от метода прямого высева, во всех исследованных экссудатах детектированы следы присутствия микроорганизмов. Концентрация микробных маркеров, а следовательно, и соответствующее им общее количество микроорганизмов колебались в пределах от Е+01 до Е+10 клеток/мл, медиана составила 3,30E+08 (1,32E+07; 1,53E+09) клеток/мл. Анализ видового состава позволил определить представителей 24 родов, относящихся к 4 крупным филумам: ActinobacteriaFirmicutesProteobacteria и Bacteroidetes (рис. 1). Большинство из них являлись минорными ассоциантами полимикробного консорциума. Среди актинобактерий (35,70% всех выявленных микроорганизмов) преобладали представители родов Propionibacterium, Rhodococcus и Actinomyces, их доля составила почти 80% в данном филуме. Наиболее многочисленная группа фирмикутов (37,40%) имела и самый разнообразный видовой состав. В перитонеальных экссудатах пациентов детектированы различные виды бацилл (Bacillus cereus, B. megaterium), клостридий (Clostridium histolyticum, С. propionicum, С. ramosum, С. difficile и С. perfringens) и эубактерий (Eubacterium biforme, E. cylindroides, E. hadrum, E. lentum и E. ventriosum). Протеобактерии (26,55%) были представлены только γ- и ε-подгруппами: Moraxella spp., Escherichia coliPseudomonas aeruginosa и Helicobacter pyloriCampylobacter mucosalis соответственно.

Рис. 1. Таксономический состав микробиоты, представленной в экссудатах пациентов с вторичным распространенным перитонитом, по данным газовой хроматографии - масс-спектрометрии

Fig. 1. Taxonomic composition of microbiota presented in exudates of patients with secondary generalized peritonitis, according to the method of gas chromatography-mass spectrometry

Анализ результатов ГХ-МС методом ординаций с помощью неметрического шкалирования показал, что численность и состав микробиоты перитонеального экссудата пациентов не зависели от пола и возраста (рис. 2).

Рис. 2. Ординационные диаграммы микробного состава экссудата в зависимости от: А - пола пациентов (мужчины - синие точки, женщины - красные точки); Б - возраста пациентов (до 50 лет - зеленые точки, >50 лет - красные точки)

Fig. 2. Ordination diagrams of the microbial composition of exudate depending on: A - gender of patients (men - blue points, women - red points); B - age of patients (up to 50 years old - green points, more than 50 years old - red points)

Обсуждение

В представленных в литературе исследованиях, посвященных изучению этиологии ВРП, при использовании бактериологического метода отмечен широкий диапазон уровня положительных высевов возбудителей: от 24 до 93%. Это объясняется различными методами и техниками, используемыми для сбора и передачи образцов, а также способами выделения чистых культур [9, 10]. По данным Y. Moenadjat и соавт. (2016), процент положительных высевов из перитонеального экссудата пациентов с абдоминальной инфекцией в 6 хирургических центрах Индонезии варьировал от 43 до 59% [11]. Доля положительных результатов бактериологического исследования экссудатов при ВРП, вызванном перфорацией червеобразного отростка или дивертикулов ободочной кишки, была несколько выше, чем при других патологиях, - 6974% [12, 13]. В нашем исследовании в общей выборке количество положительных проб составило 57,14%.

Известно, что ВРП характеризуется полимикробной этиологией. Бактериологическим методом из экссудата пациента выделяют от 4,5 до 9 возбудителей. Процент встречаемости моновидовых культур и ассоциаций в материале приблизительно равный [14]. С.В. Кемеров и соавт. (2016) проанализировали в динамике микробиоту экссудатов пациентов с ВРП; полученные данные свидетельствуют, что рост монокультуры наблюдался в 78% случаев в 2005 г. и в 75% в 2015 г. [15]. Еще более низкая доля смешанных культур в перитонеальном экссудате при перитонитах показана F. Zhou и соавт. [6]. По нашим данным, у пациентов с ВРП в большинстве проб, проанализированных бактериологическим методом, определялись монокультуры микроорганизмов, тем не менее более трети положительных высевов имели полимикробный спектр возбудителей.

Согласно результатам детекции микробных маркеров с помощью масс-спектрометрии, представительство бактерий в экссудатах пациентов с ВРП оказалось существенно выше, чем число клеток, полученных с помощью метода прямого высева. Указанный факт объясняется тем, что в последнем случае выделяются только жизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом большая часть представителей кишечной микробиоты гибнет в нетипичных условиях, а также тем, что некоторые микроорганизмы не могут быть выделены традиционными бактериологическими методами, т.е. попросту не учитываются в большинстве клинических исследований [4].

Заключение

Бактериологический метод идентификации возбудителей ВРП, помимо явных преимуществ (простота выполнения, доступность используемых средств, экономичность), имеет ряд недостатков, связанных с длительностью исследования, а также с отсутствием универсальной питательной среды для всех микроорганизмов, представленных в пробе экссудата. Диагностика этиопатогенов осложненной абдоминальной хирургической инфекции методом ГХ-МС более быстрая, чувствительная и универсальная, а также эффективная для индикации аэробных и анаэробных микроорганизмов. Невозможность дифференцировать живые и нежизнеспособные микроорганизмы, а также оценить их антибиотикочувствительность являются существенными недостатками метода и ограничивают его широкое применение для идентификации возбудителей ВРП.

Благодарности. Авторы выражают благодарность кандидату геолого-минералогических наук, руководителю группы физико-химических исследований М.А. Шишкину и инженеру Н.П. Шерстобитовой за проведение анализа ГХ-МС.

Литература

1.    Calandra T., Cohen J. The international sepsis forum consensus conference on definitions of infection in the intensive care unit // Crit. Care Med. 2005. Vol. 33, N 7. P. 1538-1548. DOI: https://doi.org/10.1097/01.CCM.0000168253.91200.83

2.    Sartelli M. A focus on intra-abdominal infections // World J. Emerg. Surg. 2010. Vol. 5, N 1. P. 1-20. DOI: https://doi.org/10.1186/1749-792 2-5-9

3.    Sartelli M., Chichom-Mefire A., Labricciosa F.M., Hardcastle T., Abu-Zidan F.M., Adesunkanmi A.K. et al. The management of intra-abdominal infections from a global perspective: 2017 WSES guidelines for management of intra-abdominal infections // World J. Emerg. Surg. 2017. Vol. 12, N 29. P. 1-34. DOI: https://doi.org/10.1186/s13017-017-0141-6

4.    She R.C, Romney M.G, Jang W., Walker T., Ka-richu J.K., Richter S.S. Performance of the BacT/Alert Vir-tuo Microbial Detection System for the culture of sterile body fluids: prospective multicentre study // Clin. Microbiol. Infect. 2018. Vol. 24, N 9. P. 992-996. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.cmi.2017.12.011

5. Федосова Н.Ф., Лядов К.В., Осипов Г.А. Новые подходы к анализу инфекционных послеоперационных и посттравматических осложнений // Инфекции в хирургии. 2010. Т. 8, № 2. С. 56-62.

6.    Zhou F., Sun S., Sun X., Chen Y., Yang X. Rapid and sensitive identification of pleural and peritoneal infections by droplet digital PCR // Folia Microbiol. 2021. Vol. 66. P. 213-219. DOI: https://doi.org/10.1007/s12223-020-00834-0

7.    Hardick J., Won H., Jeng K., Hsieh Y.-H., Gay-dos C.A., Rothman R.E. et al. Identification of bacterial pathogens in ascitic fluids from patients with suspected spontaneous bacterial peritonitis by use of broad-range PCR (16S PCR) coupled with high-resolution melt analysis // J. Clin. Microbiol. 2012. Vol. 50, N 7. P. 2428-2432. DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.00345-12

8. Верховцева Н.В., Осипов Г.А. Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии в изучении микробных сообществ почв агроценоза // Проблемы агрохимии и экологии. 2008. № 1. С. 51-54.

9.    Gladman M.A., Knowles C.H., Gladman L.J., Payne J.G. Intra-operative culture in appendicitis: traditional practice challenged // Ann. R. Coll. Surg. Engl. 2004. Vol. 86, N 3. P. 196-201. DOI: https://doi.org/10.1308/003588404323043346

10.    Maltezou H.C., Nikolaidis P., Lebesii E., Dimit-riou L., Androulakakis E., Kafetzis D.A. Pi peraci lli n/Tazo-bactam versus cefotaxime plus metronidazole for treatment of children with intra-abdominal infections requiring surgery // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001. Vol. 20, N 9. P. 643-646. DOI: https://doi.org/10.1007/s100960100581

11.    Moenadjat Y., Lalisang T.J., Saunar R.S., Usman N., Handaya A.Y., Iswanto J. et al. Epidemiology of microorganisms in intraabdominal infection/complicat-ed intraabdominal infections in six centers of surgical care in Indonesia: a preliminary study // N. Ropanasuri J. Surg. 2017. Vol. 2, N 2. P. 46-53. DOI: https://doi.org/10.7454/nrjs.v2i2.35

12.    Jang J.Y., Lee S.H., Shim H., Choi J.Y., Yong D., Lee J.G. Epidemiology and microbiology of secondary peritonitis caused by viscus perforation: a single-center retrospective study // Surg. Infect. 2015. Vol. 16, N 4. P. 436-442. DOI: https://doi.org/10.1089/sur.2014.148

13.    Boueil A., Guegan H., Colot J., D’Ortenzio E., Guerrier G. Peritoneal fluid culture and antibiotic treatment in patients with perforated appendicitis in a Pacific Island // Asian J. Surg. 2015. Vol. 38, N 4. P. 242-246. DOI: https://doi.org/10.1016/j.asjsur.2015.03.005

14.    Obinwa O., Casidy M., Flynn J. The microbiology of bacterial peritonitis due to appendicitis in children // Ir. J. Med. Sci. 2014. Vol. 183, N 4. P. 585-591. DOI: https://doi.org/10.1007/s11845-013-1055-2.

15. Кемеров С.В., Доржиева Т.С., Степин Д.А., Кемерова З.С. Исследование микробного пейзажа перитонеального экссудата при остром распространенном гнойном перитоните // Казанский медицинский журнал. 2016. T. 97, № 5. С. 806-811.

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Дземешкевич Сергей Леонидович
Доктор медицинских наук, профессор (Москва, Россия)
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии.

28-29 апреля 2022 г. в Екатеринбурге состоится IX Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО). Свое название конференция получила неслучайно, ведь именно в городе, расположенном на границе Европы и Азии, раз в два года встречаются офтальмологи из разных регионов...

Актуальные вопросы нейроофтальмологии,

Уважаемые коллеги! 28 января 2022 года состоится XXI научно-практическая нейроофтальмологическая конференция " Актуальные вопросы нейроофтальмологии. Поражение зрительного нерва: взгляд офтальмолога, невролога, вирусолога-ифекциониста, нейрохирурга " Конференция посвящается...

Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением.

В Москве пройдет Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением, с международным участием С 28 февраля по 2 марта 2022 года пройдет научно-образовательное мероприятие для врачей - Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением. Ожирение представляет одну из...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»