Наиболее распространенным нарушением
ритма сердца является фибрилляция предсердий (ФП). Ежегодно ФП диагностируется
более чем у 33 млн людей во всем мире и является главной причиной
госпитализаций по поводу аритмий. В настоящее время патофизиологические
механизмы ФП до конца не изучены и включают динамическое взаимодействие многих
звеньев, среди которых субстрат аритмии, триггеры и факторы, поддерживающие ее
персистирование.
Чаще всего ФП начинается с пароксизмальной формы, для которой
характерно спонтанное купирование в течение 48 ч, а переход в постоянную форму
происходит у 40% пациентов [1, 2]. При длительном персистировании ФП возникает
ремоделирование миокарда, которое включает
в себя структурные, ионные и механические изменения, способствующие
индукции, поддержанию и ее дальнейшему
прогрессированию [3]. Как известно [4], в течение первых суток персистирования
ФП развивается электрическое ремоделирование, которое проявляется укорочением
предсердного потенциала действия, рефрактерности и потерей адаптации потенциала
действия к частотным изменениям, что, в свою очередь, способствует
прогрессивному увеличению продолжительности ее эпизодов. Персистирование ФП
приводит к укорочению эффективного рефрактерного периода, уменьшая длину
циркулирующего электрического фронта, что облегчает ускорение и стабилизацию
устойчивого re-entry. Основными детерминантами укорочения потенциала действия
(ПД) являются снижение ионов Ca2+ и увеличение ионов K+
[5]. На электрофизиологические параметры предсердий активно влияет внеклеточный
калий: как гипокалиемия [6], так и
гиперкалиемия [7] связаны с повышенным риском развития ФП [8].
Одним из установленных факторов риска ФП является ишемическая
болезнь сердца (ИБС). Острая ишемия предсердий в течение нескольких минут
вызывает выраженное замедление проводимости, что способствует стабилизации
фронта re-entry ФП [9, 10].
После операций на сердце с использованием кардиоплегических
растворов у больных с ИБС выявляется одна из наиболее распространенных форм
нарушения ритма ФП, которая развивается в 30-50% случаев у пациентов после
операций на сердце [11-13]. Послеоперационная
ФП, как правило, возникает между 2-ми и 4-ми сутками после операции с пиковым
значением возникновения на 2-е сутки после операции. По данным метаанализа
проведенных исследований, у 70% пациентов ФП возникает в первые 4 сут после
операции, и у 96% - в течение 6 сут после операции [14].
Патогенез этого осложнения до конца не изучен, однако
известна роль многих факторов его развития и поддержания. Одним из таких
наиболее значимых факторов являются электролитные нарушения, связанные с
нарушением работы ионных каналов после введения кардиоплегических растворов.
Цель - изучение влияния кардиоплегии на
изменение электрофизиологических свойств
и функций ионных каналов INav предсердных кардиомиоцитов человека до и после введения
кардиоплегического раствора.
Материал и методы
В данное исследование вошли 30 пациентов с ИБС, пролеченных в кардиохирургическом
отделении. Из них 22 (73,3%) пациентам выполнено коронарное шунтирование, 6
(20%) - коронарное шунтирование в сочетании с протезированием клапана и 2
(6,7%) - коронарное шунтирование в сочетании с резекцией аневризмы левого
желудочка (ЛЖ). У всех пациентов в анамнезе не было зарегистрированных случаев
нарушения предсердного ритма в до- и послеоперационном периодах. В табл. 1
представлены исходные данные пациентов.
Таблица 1. Исходные данные группы исследованных пациентов
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,583,,4,photo1,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Выделение кардиомиоцитов человека
Чтобы оптимизировать и усовершенствовать метод, было
проведено в общей сложности 32 выделения кардиомиоцитов из хирургических
образцов (биопсия) правого предсердия человека. В этом исследовании мы приняли
во внимание текущие записи 26 пациентов со средним возрастом 60 лет с ИБС (см.
табл. 1). Были изучены 2 типа хирургических образцов, полученных до и после
введения Кустодиола. Исследование проводилось в соответствии с этическими
принципами проведения биомедицинских исследований. Добровольное информированное
согласие было получено от всех пациентов.
Образцы биоптата доставлялись в
лабораторию в холодном растворе Кустодиола (Dr. Franz Koehler Chemi GmbH,
Германия). В состав раствора Кустодиола входили: L-гистидин 180 мм, L-гистидин
хлорид моногидрат 18 мм, L-триптофан 2 мм, KCl 9 мм, CaCl2 0,015 мм,
К-кетоглутарат 1 мм, MgCl2 4 мм, маннитол 30 мм, NaCl 15 мм. Метод
выделения, описанный G. Guo и соавт.
[15], с некоторыми изменениями для условий нашей лаборатории, касающимися
состава и концентраций ферментов:
использовались проназа (Roche) в концентрации 1,7 мг/мл и коллагеназа IV типа
(Gibco) в концентрации 1,28 мг/мл [16]. Оптимизированный протокол выделения из
биоптата состоял из ферментативного воздействия на ткань сердца. Образец биоптата
измельчали на фракции длиной 1-2 мм в холодном буфере, не содержащем Ca2+,
в соответствии с данными G. Guo и соавт. [15] Затем фракции промывали в стакане
на магнитной мешалке со скоростью 250-350 об/мин в течение 9-10 мин 2 раза при
комнатной температуре. Таким образом, фракции образца биоптата были отмыты от
остатков кардиоплегического раствора.
Во время промывания готовили раствор ферментативного буфера,
буфера, не содержащего Са2+, добавляя коллагеназу IV типа в
концентрации 1,28 мг/мл и проназу в
концентрации 1,7 мг/мл; этот ферментативный буфер добавляли к фракциям биоптата
и инкубировали при перемешивании при 37 °C в течение 7-13 мин. Затем цикл
инкубации при 37 °C с непрерывным перемешиванием проводили в ферментативном
буфере, содержащем только коллагеназу IV типа в концентрации 1,28 мг/мл, по меньшей мере 3 раза в течение 7-15 мин.
Отбирали надосадочную жидкость и добавляли новую порцию ферментативного буфера
того же состава после каждого цикла инкубации. Чтобы увеличить выход
кардиомиоцитов, в конце цикла ферментации раствор с фракциями биоптата можно
растирать с помощью пастеровской пипетки 10-15 раз. После каждого цикла
инкубации с коллагеназой IV типа супернатант фильтровали с использованием
нейлоновой сетки с размером пор 100 мкм, затем центрифугировали при 800 об/мин в течение 1-3 мин. После
центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в буферном
растворе, не содержащем Ca2+. Последним шагом было добавление ионов
кальция в суспензию кардиомиоцитов (согласно G. Guo и соавт.). После этого
этапа, через 30 мин, изолированные кардиомиоциты человека были готовы к
исследованию в соответствии с поставленными задачами. Структура кардиомиоцитов
проверялась с помощью конфокальной
микроскопии.
Электрофизиологический метод
Токи изолированных кардиомиоцитов регистрировали методом
пэтч-клампа в конфигурации "целая клетка" амфотерицин В (Sigma Aldrich)
использовали в качестве перфорирующего агента в концентрации 0,24 мг/мл.
Суспензию с выделенными клетками человека помещали в камеру с внеклеточным
раствором. Стандартный внеклеточный раствор, используемый для регистрации всех
токов, содержит 150 мм NaCl, 5,4 мм KCl, 1,8 мм CaCl2, 1 мм MgCl2,
1 мм Na-пирувата, 15 мм D-глюкозы, 15 мм HEPES/NaOH (рН 7,4 NaOH). Пипетку
заполняли внутриклеточным раствором: 150 мм KCl, 5 мм NaCl, 2 мм CaCl2,
5 мм EGTA, 10 мм HEPES/NaOH, 5 мм MgATP (рН 7,2 КОН). Эксперименты проводились
с использованием установки пэтч-кламп, состоящей из следующих основных
элементов: цифрового преобразователя Digidata 1440A (Axon Instruments, Inc.,
США), усилителя Axopatch 200B (Axon Instruments, Inc., США), микроманипулятора
MP-285 (Sutter Instrument), инвертированного микроскопа Olympus IX71, Humbug
шумоизолятора (A-M-Systems), антивибрационной платформы (AVTT75), NC-324C
(WarnerInstruments). Для изготовления пипеток: съемник микропипеток P-97
(Sutter Instrument), заготовки из боросиликатного стекла (BF150-86-10,
SutterInstrument), микропеленка (Microforge, MF-900, Нарисиге). Пипетки были
изготовлены из боросиликатного стекла с сопротивлением наконечника 2-4 МОМ.
Смещение пипетки было отрегулировано до 0 непосредственно перед формированием
гигаомного контакта (GΩ). После формирования гигаомного сопротивления емкостные
компоненты были компенсированы с помощью
настроек усилителя. Окончание перфорации мембраны амфотерицином В
определяли по изменению емкостных токов. После того как сопротивление Ra было
скомпенсировано, потенциал-зависимые натриевые каналы были зарегистрированы с
использованием установленного протокола стимуляции. При необходимости
последовательное сопротивление компенсировалось. Вольт-амперная зависимость INav
определялась с использованием протокола
стимулирующего шага от -80 до +15 мВ с длительностью 100 мс с шагом 5 мВ.
Емкость мембраны, измеренная с помощью программного обеспечения CLAMP10.2,
составляла от 13 до 50 Пф. Все эксперименты пэтч-кламп проводили при
физиологической температуре 37 °C.
Сравнивались средние значения токов INav двух
групп кардиомиоцитов человека: полученных из предсердных биоптатов до и после
кардиоплегии. Транспортировка биоптатов до лаборатории проводилась в холодном
растворе Кустодиол. Время транспортировки занимало не более 1 ч в специальном боксе. Выделение кардиомиоцитов
выполнено по предложенной методике [16].
Были исследованы INav кардиомиоцитов правого
предсердия человека, выделенных из двух типов хирургических образцов: 1)
полученных до и 2) после применения
кардиоплегического раствора Кустодиол. Кардиомиоциты предсердий добавляли в
камеру, помещенную на предметный столик микроскопа, через 30 мин после
выделения. Эксперименты проводились во внеклеточном растворе без Кустодиола.
Токи изолированных кардиомиоцитов регистрировались с помощью
метода пэтч-кламп, а зависимость от
напряжения пиковых токов INav определялась при помощи стимулирующего
ступенчатого протокола от -80 до 15 мВ длительностью 100 миллисекунд с шагом в
5мВ. Анализ и обработка данных
выполнялись с использованием программ Clampfit 10.2 (Molecular Devices, США) и
OriginPro 8.1 (OriginLab Corporation, США).
Интраоперационные данные представлены в табл. 2.
Таблица 2. Интраоперационные данные группы исследованных пациентов
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,583,,4,photo2,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Примечание. АКШ - аортокоронарное шунтирование; ИВЛ - искусственная вентиляция
легких; ОРИТ - отделение реанимации и
интенсивной терапии.
Все операции выполнялись в плановом порядке, по стандартному
протоколу и со стандартным обеспечением. Кардиоплегия в корень аорты
производилась раствором Кустодиол (30 мл/кг).
Результаты
Вольт-амперная зависимость показала уменьшение амплитуды
быстрого натриевого тока на 13% и максимальное смещение на 12 мВ после
применения Кустодиола по сравнению с кривыми, полученными до применения
Кустодиола (рис. 1А, Б).
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,583,,4,photo3,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Быстрый натриевый ток INav предсердного кардиомиоцита
человека: A. Нормализованная вольт-амперная характеристика быстрого натриевого
тока INav кардиомиоцитов предсердий человека до (серая кривая, n=24)
и после (черная кривая, n=23) применения Кустодиола; Б. Изменение
амплитуды быстрого натриевого тока INav кардиомиоцитов предсердий
человека до (n=24) и после (n=23) применения Кустодиола; В.
Кривая активации m для быстрых натриевых каналов кардиомиоцитов человека
до и после применения Кустодиола
Fig. 1. Fast
sodium current INav of a human atrial cardiomyocyte: A. Normalized
current-voltage characteristic of the fast sodium current INav of human atrial
cardiomyocytes before (grey curve, n=24) and after (black curve, n=23)
Custodiol application; B. Change in the amplitude of fast sodium current INav
of human atrial cardiomyocytes before (n=24) and after (n=23)
application of Custodiol; B. Activation curve m for fast sodium channels in
human cardiomyocytes before and after application of Custodiol
На рис. 1В показана активационная зависимость INav
до и после введения кардиоплегического раствора Кустодиол. Из активационных
кривых получили полувысоту V1/2 = -53,05 ± 0,76 и наклон
кривой активации dx = 4,17 ± 0,38 до кардиоплегии и после кардиоплегии V1/2 =
-35,19 ± 0,71 и dx = 1,89 ± 0,18.
После введения кардиоплегического раствора сдвиг полувысоты кривой активации
составил 18 мВ.
Данные результаты свидетельствуют об изменении динамики
активации INav (см. рис. 1) и
снижении скорости проведения (рис. 2). В периодах стимуляции от 425 до 675 мс
наблюдается стабильное различие скоростей проведения. На рис. 2 показана фаза быстрой деполяризации мембраны
(шаг по времени - 1 мс). Имитируя процесс развития INav после
воздействия кардиоплегического раствора, получается более пологая фаза быстрой
деполяризации.
![](https://www.medobr.ru/cgi-bin/unishell?usr_data=gd-image(jarticles_cesurg,583,,4,photo4,00000000,)&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. На графике изображена зависимость
скорости проведения волны от периода стимуляции
Fig. 2. The graphshow
sthedependence of the wave conduction
velocityon the stimulation period
Обсуждение
В данной работе изучено влияние кардиоплегического раствора
Кустодиол на потенциал-зависимые ионные каналы INav предсердных
кардиомиоцитов человека, выделенных из биоптата предсердия человека,
полученного во время операции аортокоронарного шунтирования. По данным
вольт-амперных кривых видно уменьшение амплитуд INav на 13%, со
сдвигом активационной кривой INav на 18 мВ после нахождения
кардиомиоцитов в кардиоплегическом
растворе в течение 90 мин.
На основе полученных данных проведена оценка влияния
кардиоплегического раствора на скорость распространения волны возбуждения в сердечной ткани.
Для симуляции проведения волны
возбуждения применялась модель желудочковых кардиомиоцитов TNNP. Хоть данная
модель не может полностью отразить особенности электрофизиологии предсердных
кардиомиоцитов, таких как точное значение длительности потенциала действия и его форму [17], динамика тока INav
формулируется одинаково как в модели TNNP, так и в специализированных моделях
предсердных кардиомиоцитов [17, 18]. Наибольшее значение тока INav заключается
в определении свойства переднего фронта волны возбуждения, распространяющейся
по ткани. А передний фронт определяет скорость распространения возбуждения
[19], поэтому характер различия скоростей, полученный в модели TNNP, должен
воспроизводиться и в других моделях с аналогичной динамикой INav.
Влияние других ионных каналов на скорость проведения волны может быть значимым
лишь в том случае, если период стимуляции близок к длительности потенциала
действия (около 300 мс для желудочковых кардиомиоцитов и 200 мс для
предсердных). В нашем случае оценка скорости проведения происходит при периодах
стимуляции, превышающих длительность потенциала действия как предсердных, так и
желудочковых кардиомиоцитов (рис. 2), что нивелирует влияние других ионных
каналов (исключая INav) на скорость волны возбуждения.
Кардиоплегический раствор Кустодиол - это
внутриклеточный раствор с низким содержанием ионов натрия и кальция, которое
вызывает гиперполяризацию мембраны кардиомиоцита, обеспечивая асистолию сердца
в диастолу. Наше исследование показывает, что под действием кардиоплегического
раствора Кустодиол уменьшается амплитуда потенциал-зависимых быстрых натриевых
токов INav, а кривая активации сдвигается вправо и
меняется активационная зависимость INav, что, в свою очередь,
уменьшает скорость проводимости волны возбуждения в сердечной ткани.
Заключение
По данным, полученным в нашем пилотном
исследовании, видно, что после кардиоплегии раствором Кустодиол уменьшается
амплитуда быстрого натриевого тока INav со сдвигом активационной
кривой вправо, и указывает на то, что часть быстрых натриевых каналов
инактивирована. Таким образом, полученные данные показывают уменьшение скорости
проводимости волны возбуждения в сердечной ткани в 1,47±0,10 раза. По нашему
мнению, это может являться субстратом аритмогенности, приводящим к нарушению ритма в раннем послеоперационном
периоде. В этой связи актуальным становится поиск решений, которые в дальнейшем
помогут исключить или минимизировать данные осложнения. Одним из таких путей
может стать персонифицированный подход к
антиаритмической терапии до и после операции,
а также коррекция электролитного баланса во время искусственного
кровообращения.
Литература
1.
Chugh S.S., Havmoeller R., Narayanan K. et al. Worldwide
epidemiology of atrial fibrillation: a Global Burden of Disease 2010 Study //
Circulation. 2014. Vol. 129, N 8. P. 837-847. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.
113.005119
2.
Padfield G.J., Steinberg C., Swampillai J. Progression of
paroxysmal to persistent atrial fibrillation: 10-year follow-up in the Canadian
Registry of Atrial Fibrillation // Heart Rhythm. 2017. Vol. 14, N 6. P.
801-807. DOI: https://doi.org/10.1016/j.hrthm.2017.01.038
3.
Jalife J., Kaur K. Atrial remodeling, fibrosis, and atrial
fibrillation // Trends Cardiovasc. Med. 2015. Vol. 25, N 6. P.
475-484. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcm.2014.12.015
4.
de Vos C.B., Pisters R., Nieuwlaat R. et
al. Progression
from paroxysmal to persistent atrial fibrillation clinical correlates and
prognosis // J. Am. Coll. Cardiol. 2010. Vol. 55, N 8. P. 725-731. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jacc.
2009.11.040
5.
Martins R.P., Kaur K., Hwang E. et al. Dominant frequency
increase rate predicts transition from paroxysmal to long-term persistent
atrial fibrillation // Circulation. 2014. Vol. 129, N 14. P. 1472-1482. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.
113.004742
6.
Krijthe B.P., Heeringa J., Kors J.A. et al. Serum potassium
levels and the risk of atrial fibrillation: the Rotterdam Study // Int. J.
Cardiol. 2013. Vol. 168. P. 5411-5415. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2013.08.048
7.
Lancaster T.S., Schill M.R., Greenberg J.W. et al. Potassium
and magnesium supplementation do not protect against atrial fibrillation after
cardiac operation: a time-matched analysis // Ann. Thorac. Surg. 2016. Vol.
102. P. 1181-1188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.athoracsur.2016.06.066
8.
Lu Y.Y., Cheng C.C., Chen Y.C. et al. Electrolyte
disturbances differentially regulate sinoatrial node and pulmonary vein
electrical activity: a contribution to hypokalemia- or hyponatremia-induced
atrial fibrillation // Heart Rhythm. 2016.
Vol. 13. P. 781-788. DOI: https://doi.org/10.1016/j.hrthm.2015.
12.005
9.
Sinno H., Derakhchan K., Libersan D. et al. Atrial ischemia
promotes atrial fibrillation in dogs // Circulation. 2003. Vol. 107. P. 1930-1936. DOI: https://doi.org/10.1161/01.CIR.00000587
43.15215.03
10.
Álvarez-García J., Vives-Borrás M., Gomis P. et al.
Electrophysiological effects of selective atrial coronary artery occlusion in
humans // Circulation. 2016. Vol. 133. P. 2235-2242. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.116.021700
11.
Kaw R., Hernandez A.V., Masood I. et al. Short-and long-term
mortality associated with new-onset atrial fibrillation after coronary artery
bypass grafting: a systematic review and meta-analysis // J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 2011. Vol. 141, N 5. P. 1305-1312. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2010.10.040
12. Maesen
B., Nijs J., Maessen J. et al. Post-operative atrial fibrillation: a maze of
mechanisms // Europace. 2012. Vol. 14, N
2. P. 159-174. DOI: https://doi.org/10.1093/europace/eur208
13.
Бокерия О.Л., Ахобеков А.А. Эффективность статинов в
профилактике фибрилляции предсердий после кардиохирургических операций // Анналы
аритмологии. 2014.
Т. 11, № 1. С. 14-23. DOI: https://doi.org/10.15275/annaritmol.2014.1.2
14.
Aranki S.F., Shaw D.P., Adams D.H. et al. Predictors of atrial fibrillation after coronary artery
surgery. Current trends and impact on hospital resources // Circulation. 1996.
Vol. 94. P. 39-70. DOI: https://doi.org/10.1161/01.CIR.94.3.390
15.
Guang-Ran Guo, Liang Chen, Man Rao, Kai Chen, Jiang-Ping
Song, Sheng-Shou Hu. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to
model cardiac diseases // J. Transl. Med. 2018. Vol. 16. P. 288. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-018-1649-6
16.
Шумаков Д.В., Агладзе К.И., Зыбин Д.И., Попов М.А.,
Фролова Ш. Р., Романова С.Г. Способ выделения кардиомиоцитов из ткани сердца
человека. Патент на изобретение 2749986 C1, 21.06.2021. Заявка № 2020138993 от 27.11. 2020.
17.
Cohn J.N. Structural basis for heart failure. Ventricular
remodeling and its pharmacological inhibition // Circulation. 1995. Vol. 91, N
10. P. 2504-2507. DOI: https://doi.org/10.1161/01.CIR.91.10.2504
18.
St John Sutton M., Pfeffer M.A., Moye L., Plappert T.,
Rouleau J.L., Lamas G. et al. Cardiovascular death and left ventricular
remodeling two years after myocardial infarction: baseline predictors and
impact of long-term use of captopril: information from the Survival and
Ventricular Enlargement (SAVE) trial // Circulation. 1997. Vol. 96, N 10. P.
3294-3299. DOI: https://doi.org/10.1161/01.cir.96.10.3294
19.
Gaudron P., Eilles C., Kugler I., Ertl G. Progressive left
ventricular dysfunction and remodeling after myocardial infarction. Potential
mechanisms and early predictors // Circulation. 1993. Vol. 87, N 3. P. 755-763.
DOI: https://doi.org/10.1161/01.CIR.87.3.755