Результаты долгосрочной проходимости и прижизненной визуализации сосудистых заплат из фиброина шелка

• Колесников А.Ю.
• Прокудина Е.С.
• Сенокосова Е.А.
• Арнт А.А.
• Антонова Л.В.
• Миронов А.В.
• Кривкина Е.О.
• Кочергин Н.А.

Резюме

Актуальность. Сосудистые заплаты, применяемые при реконструктивных операциях, неоптимальны из-за различия в комплаентности материала и тканей стенки артерии. Основные недостатки: тромбозы, аневризмы и рестенозы в зоне анастомоза. Актуальна проблема оценки их функционирования и эндотелизации на разных сроках имплантации. Одним из методов решения данной проблемы является оптическая когерентная томография (ОКТ).

Цель - оценить результаты долгосрочной проходимости и прижизненной визуализации сосудов с заплатами из фиброина шелка (ФШ), а также обосновать возможность применения ОКТ для оценки функционирования и эндотелизации сосудистых заплат в эксперименте на крупных лабораторных животных.

Материал и методы. Сосудистые заплаты из ФШ изготавливали методом электроспиннинга. Для сравнения использовали лоскуты из бычьего ксеноперикарда (КП). Заплаты (n=4) имплантировали в стенку сонных артерий овец сроком на 2 и 6 мес. Проходимость сосудов с заплатами оценивали с помощью ультразвукового исследования (УЗИ). Функционирование и эндотелизацию сосудистых заплат в сонной артерии исследовали с помощью ОКТ. После эксплантации сосудистые заплаты изучали с помощью гистологических методов исследования.

Результаты. По данным УЗИ сосуды с заплатами на сроке 2 и 6 мес были проходимы, гематом и аневризм не выявлено. По данным ОКТ через 2 мес имплантации в проекции заплаты из ФШ наблюдалась гиперплазия неоинтимы (средняя толщина 370 мкм); на внутренней поверхности заплаты из КП неоинтима была выражена в зоне анастомоза с толщиной 230 мкм. Через 6 мес имплантации обнаружена гиперплазия неоинтимы сонной артерии с заплатой из ФШ (средняя толщина неоинтимы 350 мкм). На внутренней поверхности заплаты из КП также выявлена гиперплазия неоинтимы (средняя толщина 265 мкм). Гистологическое исследование подтвердило результаты, полученные методом ОКТ. Через 2 мес после имплантации была выявлена равномерная гиперплазия неоинтимы заплаты из ФШ (толщина неоинтимы от 48 до 122 мкм). Гиперплазия неоинтимы в проекции заплаты из КП обнаружена только в зонах анастомозов. Спустя 6 мес имплантации на заплате из ФШ наблюдалась выраженная гиперплазия неоинтимы (толщина слоя до 835 мкм). На заплате из КП через 6 мес имплантации гиперплазия неоинтимы невыраженная (в среднем 156 мкм).

Заключение. Сосудистые заплаты из ФШ продемонстрировали стабильность на протяжении 6 мес имплантации в стенку сонной артерии овец, не нарушали проходимость, не вызывали аневризм сосудов, однако способствовали гиперплазии неоинтимы, без признаков кальцификации и острого воспаления в зоне имплантации, что подтвердилось данными ОКТ и гистологическим исследованием. Наряду с этим ОКТ является эффективным методом in vivo оценки функционирования и эндотелизации сосудистых протезов в эксперименте.

Ключевые слова:сосудистые заплаты; внутрисосудистые методы визуализации; оптическая когерентная томография; экспериментальная медицина; неоинтима

Сосудистые протезы, применяемые при реконструктивных операциях, неоптимальны ввиду различия в комплаентности материала и тканей стенки артерии, что приводит к изменению кровотока в зоне анастомоза [1]. Основными недостатками сосудистых имплантатов являются частые тромбозы, аневризмы и рестенозы, особенно в месте анастомоза [2, 3]. Наиболее подходящим материалом для использования в качестве заплат являются аутологичные сосуды (артерии или вены), так как они обладают полной биосовместимостью, не вызывая иммунной реакции организма, устойчивы к тромбозу и рестенозу благодаря наличию эндотелиальной выстилки [4]. Также для изготовления сосудистых заплат используют ксеногенные материалы: бычий перикард, подслизистую оболочку тонкого кишечника свиньи [5, 6]. Заплаты из бычьего перикарда широко применяют, поскольку они обладают легкой доступностью, износостойкостью, минимальным кровотечением из проколов по сравнению с аутовеной [7]. Из синтетических материалов для изготовления сосудистых заплат наиболее широко используют политетрафторэтилен, полиэтилентерефталат. Проводятся исследования фиброина шелка (ФШ) в качестве потенциального биополимера для тканевой инженерии, поскольку он обладает высокой биосовместимостью [8], низкой иммуногенностью, контролируемой биорезорбируемостью [9-11].

Остается актуальной проблема прижизненной визуализации состояния и ремоделирования сердечно-сосудистых имплантатов, оценка их функционирования и эндотелизации на разных сроках после имплантации. На сегодняшний день морфологическая диагностика ремоделирования имплантированных сосудистых заплат заключается в гистологическом исследовании данных изделий после их эксплантации. Важным аспектом успешного долгосрочного функционирования является полноценная эндотелизация всей внутренней поверхности заплаты, контактирующей с кровью. Одним из потенциальных методов решения является использования метода оптической когерентной томографии (ОКТ).

Основные цели исследования - оценка результатов долгосрочной проходимости и прижизненной визуализации сосудов с заплатами из ФШ, а также обоснование возможности применения ОКТ для оценки функционирования и эндотелизации сосудистых заплат в эксперименте на крупных лабораторных животных.

Материал и методы

Исследование выполнено с включением 4 случаев имплантации сосудистых заплат из ФШ (n=2) и бычьего ксеноперикарда (КП) (n=2) в сонную артерию крупным лабораторным животным. Первичная конечная точка - смерть животного, вторичная - дисфункция сосудистой заплаты (тромбоз, аневризмы в области сосудистой заплаты).

Сосудистые заплаты изготавливали из 15% раствора регенерированного ФШ методом электроспиннинга на аппарате Nanon-01A (MECC, Япония). В качестве растворителя использовали гексофторпропанол. Последующая поверхностная модификация полученных матриксов проведена в 98% этаноле с целью перевода матриксов из регенерированного состояния в водонерастворимую форму. Для сравнения использовали сосудистые заплаты коммерческого производства из бычьего КП (Кем-Периплас Нео, ЗАО "Неокор", Россия), который используется в сосудистой хирургии.

Имплантацию сосудистых заплат в сонную артерию проводили на овцах эдильбаевской породы массой 42-45 кг, все животные - несуягные самки. Животные оперированы последовательно. При выполнении экспериментальных исследований руководствовались требованиями приказов №1179 Минздрава СССР от 10.10.1983, № 267 Минздрава России от 19.06.2003, Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Работа одобрена локальным этическим комитетом ФГБНУ "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (протокол № 6 от 30.06.2022).

Размер заплат 40,0×4,0 мм. Основные точки прижизненной визуализации и вывода животных из эксперимента - 2 и 6 мес после имплантации.

Послеоперационное УЗИ проходимости сосудов с заплатами выполняли спустя 1 и 5 сут, далее - 1 раз в 2 мес, вплоть до предполагаемого срока вывода животного из эксперимента.

Прижизненная визуализация ремоделирования заплат проведена по следующей методике: транскаротидным доступом с помощью ОКТ выполнено сканирование со скоростью 25 мм/с сегмента (5 см) сонной артерии овцы с имплантированной заплатой. Для удаления форменных элементов крови использовалась инфузия рентгеноконтрастного средства объемом 25 мл со скоростью 10 мл/с. Сроки проведения прижизненной визуализации - 1 раз в 2 мес с момента имплантации.

После выведения животного из эксперимента проведено гистологическое исследование образцов заплат, имплантированных на этапах 2 и 6 мес с окрашиванием гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и ализариновым красным С.

Эксплантированные образцы фиксировали в формалине в течение 24 ч, затем промывали проточной водопроводной водой для удаления фиксирующего раствора и обезвоживали в IsoPrep (BioVitrum, Россия). Пропитывали образцы парафином (3 порции) при 56 °C в течение 60 мин в каждой порции. Пропитанные образцы заливали парафином ГИСТОМИКС (БиоВитрум, Россия). Из полученных образцов изготавливали срезы толщиной 8 мкм с помощью микротома HM 325 (Thermo Scientific, США). Затем образцы помещали в термостат и сушили в течение ночи при 37 °C. После полного высыхания образцы депарафинизировали в о-ксилоле (3 порции) в течение 1-2 мин и дегидратировали в 96% спирте (3 порции) в течение 1-2 мин. Далее депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону или ализариновым красным С в соответствии с протоколом окрашивания. Образцы исследовали с помощью световой микроскопии на микроскопе AXIO Imager A1 (Carl Zeiss, Германия) с объективом ×50, ×100 и ×200.

Результаты

Проведено исследование сосудистых протезов через 2 и 6 мес после имплантации в сонную артерию овец. Имплантированы сосудистые протезы из ФШ (n=2) и КП (n=2).

По данным УЗИ через 2 мес после имплантации скорость кровотока в сосуде с заплатой из КП составила 56 см/с, диаметр комплекса артерия + протез - 4,8 мм. В сосуде с заплатой из ФШ скорость кровотока составила 83 см/с, диаметр комплекса артерия + протез - 5,4 мм. Спустя 6 мес после имплантации скорость кровотока в артерии с заплатой из КП составила 67 см/с, диаметр комплекса артерия + протез - 4,5 мм, с заплатой из ФШ - 65 см/с, а диаметр комплекса артерия + протез - 4,2 мм.

Таким образом, по данным УЗИ, на сроке 2 мес и к 6-му месяцу имплантации сосудистых заплат из ФШ и КП сонные артерии овец были полностью проходимы; гематом, аневризматических расширений, а также тромбов не обнаружено.

 В ходе прижизненной визуализации сосудов с помощью ОКТ выявлено, что спустя 2 и 6 мес после имплантации заплат в сонную артерию овец во всех случаях сформировалась неоинтима. На этапе 2 мес имплантации по данным ОКТ была обнаружена равномерная гиперплазия неоинтимы по всей внутренней поверхности заплаты из ФШ со средней толщиной 370 мкм; на внутренней поверхности заплаты из КП неоинтима неоднородна, выражена только в зоне анастомоза со средней толщиной 230 мкм (рис. 1А, Б). На этапе 6 мес имплантации выявлена неоднородная гиперплазия неоинтимы в области заплаты из ФШ со средней толщиной 350 мкм. На поверхности сосудистой заплаты из КП также выявлена гиперплазия неоинтимы со средней толщиной 265 мкм (рис. 1В, Г).

Таким образом, данные ОКТ подтвердили полную проходимость сонных артерий овец с имплантированными заплатами, а также свидетельствовали о наличии гиперплазии новообразованной интимы в области сосудистых протезов, которая в большей степени была выражена в случае матриксов из ФШ как на сроке 2 мес, так и через 6 мес наблюдения.

После эксплантации сосудистых заплат на сроке 2 мес в результате проведенного гистологического исследования также была выявлена равномерная гиперплазия неоинтимы на всем протяжении протеза из ФШ. Толщина новообразованной интимы составила от 48 мкм в середине до 122 мкм в зонах анастомозов. Эндотелиоподобные клетки покрывали всю поверхность неоинтимы, обращенную в просвет сосуда. Клеточность стенки заплаты была крайне низкой в центральной части с увеличением количества клеток в зонах, приближенных к анастомозам. Эластиновые волокна не определялись. Коллагеновые волокна выявлены преимущественно во внешней соединительнотканной капсуле, сформировавшейся вокруг заплаты со стороны адвентиции. Вновь сформированный адвентициальный слой был наполнен фибробластоподобными клетками, толщина его варьирует от 40 мкм в проекции середины заплата до 50 мкм в зоне анастомозов (рис. 2А-Д).

Эксплантированная заплата из КП после 2 мес имплантации сохраняла характерную коллагеновую структуру бычьего перикарда. При этом выявлено значительное расслоение стенки заплаты вдоль всей ее длины. В отличие от заплаты из ФШ, гиперплазия неоинтимы в проекции КП заплаты обнаружена только в зонах анастомозов. Однако в центре заплаты неоинтима значимо тоньше относительно ФШ (20 мкм). Эндотелизация внутренней поверхности неоинтимы проходила менее качественно - без формирования эндотелиального монослоя. Клеточность стенки КП заплаты была крайне низкой, эластин четко не визуализировался. При этом сформировался тонкий адвентициальный слой (до 72 мкм в зоне анастомозов), содержащий фибробластоподобные клетки (см. рис. 2Е-К).

По данным гистологического исследования спустя 6 мес имплантации заплаты из ФШ в стенку сосуда признаки биодеградации были выражены в большей степени, чем через 2 мес. Заплата была представлена расходящимися пластами фиброина, между которыми располагалась соединительная ткань, наполненная клетками; в толще заплаты обнаруживались вновь образованные кровеносные капилляры (vasa vasorum). Неоинтима в проекции заплаты была гиперплазирована, равномерно наполнена эндотелиоподобными клетками, ее толщина в среднем составила 835 мкм. Переход между неоинтимой и собственной интимой артерии в зоне анастомоза плавный. Адвентиция сосуда была полностью сформирована, толщина ее в проекции заплаты в среднем составила 138 мкм. Данный слой был представлен коллагеновыми волокнами, наполнен фибробластоподобными клетками, наблюдалась васкуляризация вновь образованными кровеносными капиллярами различного диаметра. Участков кальцификации в зоне заплаты не выявлено (рис. 3А-Д).

Спустя 6 мес имплантации заплата из КП сохранила волокнистую структуру, характерную для бычьего перикарда, имелись участки расслоения, однако оно было менее выражено, чем через 2 мес имплантации. Клеточность заплаты была невысокая, однако количество клеточных элементов увеличивалось в зоне перехода между заплатой и новообразованной интимой. Неоинтима представлена плоскими эндотелиоподобными клетками, гиперплазия незначительная. Толщина новообразованной интимы в центре составила 156 мкм. Адвентициальный слой плотный, представлен переплетенными волокнами коллагена, наполнен фибробластоподобными клетками, его толщина в среднем составила 180 мкм. Накопления кальция по ходу заплаты не выявлено. Обнаружен участок кальцификации в зоне анастомоза, что, вероятнее всего, явилось реакцией на шовный материал. В целом заплата из бычьего КП спустя 6 мес имплантации демонстрировала удовлетворительную интеграцию в сонную артерию овцы, подвергаясь частичному ремоделированию и стимулируя образование новых слоев сосудистой стенки (рис. 3Е-К).

Таким образом, данные гистологического исследования эксплантированных сосудистых заплат подтвердили результаты прижизненной визуализации сонных артерий овец методом ОКТ.

Обсуждение

Фиброин шелка - это волокнистый белок из шелковой нити, изготовленной из Bombyx mori и обработанной дегуммированием для удаления серицина, он обладает рядом преимуществ: ударной вязкостью, термостойкостью, биосовместимостью, биоразлагаемостью, низкой иммуногенностью [12]. Отмечена способность ФШ проявлять синергизм при комбинации с другими полимерами (формирование композитных каркасов), которые могут стимулировать клеточное поведение (например, дифференцировку, пролиферацию и прикрепление) [13]. В нашем исследовании на имплантированных заплатах из ФШ через 2 и 6 мес имплантации формировались основные элементы сосудистой стенки артерии. Гиперплазия новообразованной интимы сосуда, которую наблюдали как по данным ОКТ, так и по результатам гистологического исследования, вероятно, объясняется недостаточной комплаентностью имплантированных матриксов из ФШ и стенки артерии и требует дальнейших исследований, направленных на поиск оптимального состава материала для изготовления сосудистых заплат.

В основе использованного в нашем исследовании метода ОКТ лежит применение ближнего инфракрасного света, который позволяет выполнять визуализацию с высоким разрешением. Разрешающая способность составляет до 10 мкм при осевом разрешении и до 20 мкм при боковом разрешении, что примерно в 10 раз выше, чем при внутрисосудистом ультразвуке. Эта отличительная особенность ОКТ позволяет получать высококачественные изображения микроструктур, таких как фиброзная капсула, vasa vasorum, скопление липидов и макрофагов, оценивать эндотелизацию различных сосудистых протезов [14].

Основным недостатком метода является небольшая глубина проникновения ОКТ, которая составляет всего 2-3 мм, поэтому данный метод не подходит для оценки крупных сосудов (диаметром >6 мм). Кроме того, минусом является необходимость постоянного введения контрастного вещества во время сканирования, поскольку форменные элементы крови вызывают ослабление инфракрасного сигнала [15]. Тем не менее в проведенной нами работе ОКТ позволила в достаточной мере in vivo оценить состояние сосудистой стенки, а также процесс эндотелизации внутренней поверхности имплантированных заплат в эксперименте.

Ранее проведено исследование ex vivo по сравнению ОКТ с гистологическим исследованием с использованием 357 артериальных сегментов, полученных на аутопсии [16]. Чувствительность и специфичность для фиброзного компонента составили 79 и 98%, для кальцинированных бляшек - 96 и 97%, для бляшек, богатых липидами, - 94 и 92% соответственно. Воспроизводимость результатов ОКТ между операторами и у одного оператора были высокими (значения каппа 0,88 и 0,91 соответственно) [17].

Заключение

В представленной работе данные ОКТ были сопоставимы с результатами УЗИ, а также гистологического исследования эксплантированных сосудистых заплат, что позволяет рекомендовать этот метод прижизненной оценки ремоделирования и эндотелизации сосудистых заплат.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют сделать заключение о полной проходимости сосудов после имплантации заплат, изготовленных на основе ФШ. Выявленная гиперплазия неоинтимы в проекции имплантированной заплаты свидетельствует о недостаточной комплаентности материала и требует дальнейшего усовершенствования состава полимерной матрицы. Метод прижизненной ОКТ позволил достоверно оценить состояние сосудистой стенки и эндотелизацию внутренней поверхности артерий с имплантированными заплатами, что было подтверждено данными гистологического исследования.

Литература

1.     Севостьянова В.В., Миронов А.В., Антонова Л.В., Тарасов Р.С. Применение сосудистых заплат для артериальной реконструкции, проблемы и перспективы технологии // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2019. Т. 8, № 3. С. 116-129. DOI: https://doi.org/10.17802/2306-1278-2019-8-3-116-129  

2.     Hrbáč T., Fiedler J., Procházka V., Jonszta T., Roubec M., Pakizer D. et al. Comparison of carotid endarterectomy and repeated carotid angioplasty and stenting for in-stent restenosis (CERCAS trial): a randomised study // Stroke Vasc. Neurol. 2023. Mar 27. Article ID svn-2022-002075. DOI: https://doi.org/10.1136/svn-2022-002075  Epub ahead of print. PMID: 36972920.

3.     Paraskevas K.I., Dardik A., Gloviczki P. Management of restenosis after carotid endarterectomy or stenting // Angiology. 2023. Vol. 74, N 4. P. 305-307. DOI: https://doi.org/10.1177/00033197221133945  Epub 2022 Oct 14. PMID: 36239036.

4.     Яриков А.В., Балябин А.В., Яшин К.С., Мухин А.С. Хирургические методы лечения стеноза сонных артерий (обзор) // Современные технологии в медицине. 2015. Т. 7, № 4. С. 189-200. DOI: https://doi.org/10.17691/stm2015.7.4.25  

5.     Fang Q., Gu T., Fan J., Zhang Y., Wang Y., Zhao Y. et al. Evaluation of a hybrid small caliber vascular graft in a rabbit model // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2020. Vol. 159, N 2. P. 461-473. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2019.02.083  Epub 2019 Mar 6. PMID: 30981517.

6.     Heindel P., Feliz J.D., Fitzgibbon J.J., Rouanet E., Belkin M., Hentschel D.M. et al. Comparative effectiveness of bovine carotid artery xenograft and polytetrafluoroethylene in hemodialysis access revision // J. Vasc. Access. 2023. Apr 26. Article ID 11297298231170654. DOI: https://doi.org/10.1177/11297298231170654  Epub ahead of print. PMID: 37125779.

7.     Olsen S.B., Mcquinn W.C., Feliciano P. Results of carotid endarterectomy using bovine pericardium patch closure, with a review of pertinent literature // Am. Surg. 2016. Vol. 82, N 3. P. 221-226. PMID: 27099058.

8.     Singh R., Eitler D., Morelle R. et al. Optimization of cell seeding on electrospun PCL-silk fibroin scaffolds // Eur. Polymer J. 2020. Vol. 134. Article ID 109838.

9.     Sun W., Zhang Y., Gregory D.A., Jimenez-Franco A., Tomeh M.A., Lv S. et al. Patterning the neuronal cells via inkjet printing of self-assembled peptides on silk scaffolds // Prog. Nat. Sci. Mater. Int. 2020. Vol. 30. P. 686-696.

10. Kopp A., Smeets R., Gosau M., Kröger N. et al. Effect of process parameters on additive-free electrospinning of regenerated silk fibroin nonwovens // Bioact. Mater. 2020. Vol. 5, N 2. P. 241-252. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2020.01.010  

11. Zhang C., Zhang Y., Shao H., Hu X. Hybrid silk fibers dry-spun from regenerated silk fibroin/graphene oxide aqueous solutions // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2016. Vol. 8. P. 3349-3358.

12. Kitpipatkun P., Sutummaporn K., Kato K., Murakami T., Kobayashi K., Nakazawa Y. et al. Silk fibroin/polyurethane patch implantation in hyperglycemic rat model // J. Biomater. Appl. 2021. Vol. 36, N 4. P. 701-713. DOI: https://doi.org/10.1177/0885328221999227  Epub 2021 Mar 2. PMID: 33653156.

13. Bai J., Li H., Wang L., Shi Y., Su X., Xu C. et al. Effect of silk fibroin scaffold loaded with 17-β estradiol on the proliferation and differentiation of BMSCs // Regen. Ther. 2023. Vol. 23. P. 76-83. DOI: https://doi.org/10.1016/j.reth.2023.03.002  PMID: 37131535; PMCID: PMC10149272.

14. Raber L., Mintz G.S., Koskinas K.C., Johnson T.W., Holm N.R., Onuma Y. et al.; ESC Scientific Document Group. Clinical use of intracoronary imaging. Part 1: guidance and optimization of coronary interventions. An expert consensus document of the European Association of Percutaneous Cardiovascular Interventions // Eur. Heart J. 2018. Vol. 39. P. 3281-3300. DOI: https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehy285   

15. Tarkin J.M., Dweck M.R., Evans N.R. et al. Imaging atherosclerosis // Circ. Res. 2016. Vol. 118. P. 750-769. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.115.306247  

16. Yabushita H., Bouma B.E., Houser S.L. et al. Characterization of human atherosclerosis by optical coherence tomography // Circulation. 2002. Vol. 106. P. 1640-1645. DOI: https://doi.org/10.1161/01.cir.0000029927.92825.f6  

17. Кочергин Н.А., Кочергина А.М. Возможности оптической когерентной томографии и внутрисосудистого ультразвука в выявлении нестабильных бляшек в коронарных артериях // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022. Т. 21, № 1. С. 101-106. DOI: https://doi.org/10.15829/1728-8800-2022-2909