Особенности морфогистологической картины гомографтов в различные сроки консервации

• Калинин Р.Е.
• Сучков Игорь Александрович
• Карпов В.В.
• Климентова Э.А.
• Швальб А.П.
• Гузаиров Д.В.
• Егоров А.А.

Резюме

Цель - оценить динамику гистологических показателей трупных гомографтов при консервации в растворе RPMI 1640 в различные сроки.

Материал и методы. Выполнено морфологическое исследование трупных гомографтов общей бедренной вены и поверхностной бедренной артерии. Изучено 72 образца от одного посмертного донора. Гистологическое исследование проводилось на 7, 14, 21, 28, 35, 42-е сутки после забора гомографтов по 2 артериальных и венозных препарата соответственно. Получено 6 групп сравнения артериальных и венозных гомографтов. Изучено 36 артериальных и 36 венозных образцов. Оценена динамика толщины интимо-мускулярного комплекса, толщины мышечной оболочки и толщина внутренней эластической мембраны в артериальном гомографте и толщина стенки без адвентиции в венозном гомографте.

Результаты. Имеет место уменьшение толщины интимо-мускулярного комплекса (р=0,043) на 21% в конце 21-х суток относительно значений 7-х суток, но отмечено увеличение толщины этого показателя на 51% (р=0,001) на 28-е сутки относительно значений 21-х суток. Толщина мышечного слоя на 21-е сутки уменьшилась на 19,5% (статистически недостоверно) относительно показателей 7-х суток, но выявлено увеличение толщины мышечного слоя к 28-м суткам (р=0,01) на 49,8% относительно значений этого показателя на 21-е сутки за счет разрежения мышечной порции стенки, набухания миоцитов, изменения ядер в виде фрагментации и лизиса. Толщина внутренней эластической мембраны уменьшилась к 21-м суткам (р=0,035) на 12,3% относительно значений 7-х суток. К 42-м суткам отмечается тенденция к увеличению ее толщины. Выявлено уменьшение толщины стенки венозного гомографта без адвентиции (р=0,014) в конце 42-х суток на 23,4% к значению этого показателя на 7-е сутки, также отмечено снижение толщины венозного графта в конце 42-х суток (р=0,05) на 28,6% относительно значений 35-х суток. На протяжении всех контрольных точек полностью сохранена структура нативной стенки трупных гомографтов. Отсутствуют очаги некроза стенки во всех микропрепаратах.

Заключение. Наиболее "чувствительным" маркером некроза ткани при морфогистологическом методе исследования стенки графта является изучение динамики ее толщины в различные сроки консервации, так как отек клеток и волокон приведет к увеличению толщины стенки, а затем к последующему тотальному некрозу. К концу 28-х суток консервации выявлены статистически достоверное увеличение стенки артерии относительно показателей 21-х суток, участки разряжения мышечной ткани. Отмечена тенденция увеличения толщины стенки артерии к 42-м суткам. В венозном гомографте выявлено статистически достоверное снижение толщины стенки к концу исследования. Исходя из этих данных можно говорить о более длительной возможности хранения с целью использования венозного трупного кондуита. Оптимальным сроком применения артериальных гомографтов можно считать срок консервации в растворе RPMI 1640 до 21-х суток. Венозные гомографты возможно использовать в срок до 42-х суток.

Ключевые слова:гомографт; аллографт; морфогистологическая картина; раствор RPMI 1640

Одним из аспектов достижений в области биологических и медицинских исследований является то, что ткани и клетки человека используются все чаще и по-новому. Особое место занимает сосудистая ткань (артериальные и венозные аллографты) в хирургии магистральных артерий и вен [1, 2].

Аутовена является эталоном, применяемым в хирургии артерий нижних конечностей, не нужен подбор, консервация для ее применения. Но она не может быть использована до 40% случаев, по данным C. Moreira и соавт. [3]. По данным А.В. Покровского и соавт., в 30% случаев аутовена не может быть применена [4], а при повторных интервенциях не может использоваться в половине случаев [5]. 5-летняя проходимость составляет 40% в результате применения синтетических кондуитов на бедренно-дистально-подколенном сегменте в исследовании M. Albers [6]. Работа S. Masmejan и соавт. демонстрирует неплохие показатели в реконструкциях артерий при критической ишемии криоконсервированными гомографтами и отсутствием аутовены у 38 больных [7]. Данных в мировых источниках об использовании гомографтов в ангиохирургии артерий немало [6-8].

Ведение пациентов с нагноением зоны реконструкции остается нерешенной проблемой в сосудистой хирургии [9]. Реконструктивно-восстановительные оперативные вмешательства на сосудах зачастую выполняются повторно. Очень часто операции проводятся при наличии обширных некрозов и трофических язв. Не всегда аутовена доступна для реконструкции. Поэтому до сих пор особенно актуальным остается вопрос выбора материала для реконструкции. В медицинской литературе показана склонность ксенопротезов к аневризматической трансформации в послеоперационном периоде [10-12].

Ведение пациентов с осложнениями постоянного сосудистого доступа для гемодиализа остается также нерешенной проблемой в ангиохирургии. Не всегда в качестве альтернативы возможно использовать синтетический протез. При наличии гнойно-воспалительного процесса в зоне сосудистого протеза решений немного. Использование аллографтов в таких случаях может быть методом выбора [13].

Сегодня также возможно эффективно использовать аллографт от посмертного донора у пациентов с истинными аневризмами подколенных артерий [14].

Эффективное использования аллографтов от посмертного донора у пациентов с кровотечением после эндоваскулярного лечения критической ишемии конечности с трофическими изменениями в этапном хирургическом лечении, а также у больных с тромбированными ложными аневризмами анастомозов после ранее выполненных реконструктивных вмешательств показано в наших работах [15].

Сегодня необходимо четкое понимание возможностей применения влажносохраненных трупных гомографтов: показаний их использования, сроков хранения и "жизнеспособности". На некоторые из этих вопросов можно ответить, оценив гистологические изменения при консервации в различные сроки наблюдения.

Цель - оценить динамику гистологических показателей трупных гомографтов при консервации в растворе RPMI 1640 в разные сроки наблюдения.

Материал и методы

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики GCP (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинской декларации на базе кафедры сердечнососудистой, рентгенэндоваскулярной хирургии и лучевой диагностики ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (отделение сосудистой хирургии ГБУ РО ОКБ). Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом № 4 от 9 ноября 2021 г. Исследование зарегистрировано на платформе ClinicalTrials.gov (идентификатор NCT05455138).

Выполнено морфологическое исследование трупных общей бедренной вены и поверхностной бедренной артерии (гомографты), изъятых при мультивисцеральном заборе от посмертного донора при соблюдении всех правил и норм трансплантологии [2]. Изучено 72 образца гомографтов от одного посмертного донора.

Кондиционированы в растворах для культивации клеточных структур RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 с глутамином при температуре +4 °С. Получены 3 раствора с кондиционируемыми гомографтами. 1-й раствор - артерия и вена без добавления гентамицина и флуконозола в 500 мл раствора RPMI; 2-й раствор - артерия и вена с добавлением гентамицина (400 мкг/мл) и флуконазола (20 мкг/мл) в 500 мл раствора RPMI; 3-й раствор - артерия и вена с добавлением гентамицина (200 мкг/мл) и флуконазола (10 мкг/мл) в 500 мл раствора RPMI.

Проводилась вырезка артерий перпендикулярно их просвету (кольцо) шириной около 0,4 см, вен - продольно, длиной фрагментов до 1 см, которые затем укладывались в пластиковые кассеты и помещались в автоматический гистологический процессор Tissue-Tek VIP 6 для фиксации и проводки, происходящих в течение 12 ч. Затем выполнялась заливка в заливочные формы с пластиковыми кольцами чистым парафином в диспенсере Tissue-Tek ТЕК 5, после охлаждения изготавливались срезы толщиной до 5 мкм на микротоме ротационном полуавтоматическом Accu-Cut SRM. Срезы помещались на предметное стекло толщиной 3 мм, затем окрашивали готовыми красителями в мультистейнере автоматическом для микропрепаратов Tissue-Tek Prisma двумя методиками: гематоксилин-эозином и по Вейгерту-Ван-Гизону.

Участками разрежения мышечной оболочки мы называли зоны с плотностью расположения миоцитов меньше 80 на 0,1 мм².

Проводилось заключение окрашенных стеклопрепаратов на аппарате для гистологических срезов под пленку Tissue-Tek Film. Препараты изучались при помощи сканирующего микроскопа NanoZoomer S60 фирмы Hamamatsu.

Гистологическое исследование гомографтов из каждого раствора проводилось на 7, 14, 21, 28, 35, 42-е сутки после забора гомографтов по 2 артериальных и венозных препарата соответственно. Получено 6 групп сравнения артериальных и венозных гомографтов. Изучено 36 артериальных и 36 венозных образцов трупных гомографтов от одного посмертного донора. Оценены динамика толщины интимо-мускулярного комплекса, толщины мышечной оболочки и толщина внутренней эластической мембраны в артериальном гомографте и толщина стенки без адвентиции в венозном графте. Использовано программное обеспечение NDP.view2 (U12388-01) компании Hamamatsu Photonics KK для измерения этих показателей.

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводился с использованием пакета статистических программ STATISTICA 10.0. В связи с нормальным распределением данных (использовался критерий Шапиро-Уилка, р>0,05) для дальнейшего анализа применялись параметрические тесты. Для оценки статистической значимости различий внутри групп использовался дисперсионный анализ повторных измерений (ANOVA), попарные сравнения выполнялись с помощью критерия Ньюмена-Кейсла. Принятый уровень статистической значимости - р<0,05. Числовые данные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение.

Результаты

Методика измерения толщины интимо-мускулярного комплекса, толщины мышечной оболочки и толщина внутренней эластической мембраны в артериальном гомографте заключалась в следующем: измеряли минимальные и максимальные размеры показателей каждого микропрепарата артериального гомографта отдельно в исследуемые сроки. В результате получено 6 минимальных и 6 максимальных значений для каждого показателя на 7, 14, 21, 28, 35, 42-е сутки после забора материала. Затем получены средние их значения. Выполнена статистическая обработка.

Стенка сосуда с исследуемыми показателями представлена на рис. 1.

Проведена гистологическая оценка исследуемых образцов артериальных гомографтов и полученные результаты представлены в табл. 1.

Согласно полученным результатам, имеет место уменьшение толщины интимо-мускулярного комплекса (р=0,043) на 21% в конце 21-х суток относительно значений 7-х суток, но отмечено увеличение толщины этого показателя на 51% (р=0,001) в 28-е сутки относительно значений 21-х суток.

Толщина мышечного слоя на 21-е сутки уменьшилась на 19,5% (статистически недостоверно) относительно показателей 7-х суток, но выявлено увеличение толщины мышечного слоя к 28-м суткам (р=0,01) на 49,8% относительно значений этого показателя на 21-е сутки.

Толщина внутренней эластической мембраны уменьшилась к 21-м суткам (р=0,035) на 12,3% относительно значений 7-х суток. К 42-м суткам отмечается тенденция к увеличению ее толщины.

К концу 7-х суток участки разрежения мышечной оболочки не наблюдаются, ядра миоцитов сохранены (рис. 2).

Участки разряжения мышечной ткани выявлены к концу 28-х суток (рис. 3).

Методика измерения толщины стенки вены без адвентиции в венозном гомографте заключалась в следующем: измерялись минимальные и максимальные размеры показателя каждого микропрепарата венозного гомографта отдельно в исследуемые сроки. В результате получено 6 минимальных и 6 максимальных значений показателя на 7, 14, 21, 28, 35, 42-е сутки после забора материала. Затем получены средние его значения. Выполнена статистическая обработка.

Стенка вены с исследуемым показателями представлена на рис. 4.

Проведена гистологическая оценка исследуемых образцов венозных гомографтов. Средние значения и стандартные отклонения исследуемого показателя алловены представлены в табл. 2.

Выявлено уменьшение толщины стенки венозного гомографта без адвентиции (р=0,014) в конце 42-х суток на 23,4% к значению этого показателя на 7-е сутки, также отмечено снижение толщины венозного графта в конце 42-х суток (р=0,05) на 28,6% относительно значений 35-х суток.

На протяжении всех контрольных точек полностью сохранена структура нативной стенки трупных гомографтов. Отсутствуют очаги некроза стенки во всех микропрепаратах.

Обсуждение

Некроз - омертвение, гибель клеток и тканей в живом организме; при этом жизнедеятельность их полностью прекращается. Консервированные гомографты в растворе RPMI 1640 должны сохранять "жизнеспособность" в течение определенного срока. Клетки стенки сосуда продолжают свой метаболизм, а это означает, что они выделяют продукты метаболизма, которые в норме "уносятся" кровотоком. In vitro кровоток отсутствует, следовательно продукты распада остаются в местах выделения, что приводит к "отравлению" клетки. В результате запускается механизм апоптоза. Своеобразной формой некроза является апоптоз. В основе апоптоза лежит разделение клетки на части с образованием апоптозных тел (фрагменты клетки, окруженные мембраной и способные к жизнедеятельности) [16].

К микроскопическим признакам апоптоза относятся характерные изменения клетки и межклеточного вещества - кариопикноз (конденсация хроматина), кариорексис (распад ядра), кариолизис (растворение ядра), набухание коллагеновых и эластических волокон, их распад и лизис [16]. Большинство из этих процессов возможно верифицировать простыми морфогистологическими методами исследования.

В нашем исследовании на протяжении всех контрольных точек полностью сохранена структура нативной стенки трупных гомографтов. Отсутствуют очаги некроза стенки во всех микропрепаратах.

По нашему мнению, "чувствительным" маркером некроза ткани при морфогистологическом методе исследования стенки графта является изучение динамики ее толщины в различные сроки консервации, так как отек клеток и волокон приведет сначала к увеличению толщины стенки, а затем к тотальному некрозу. В нашем исследовании показано уменьшение толщины стенки без адвентиции, толщины мышечной ее части и внутренней эластической мембраны в артериальном гомографте к концу 21-х суток в сравнении с этими показателями к исходу 7-х суток, что говорит об отсутствии процесса набухания и отека структур стенки. Но к концу 28-х суток выявлено статистически достоверное увеличение стенки артерии относительно показателей 21-х суток. Также выявлены участки разрежения мышечной стенки, набухание миоцитов, изменения ядер в виде фрагментации и лизиса к концу 28-х суток консервации артериального гомографта. Именно поэтому срок хранения до 21-х суток целесообразно считать оптимальным для использования артериального графта в ангиохирургии.

Заключение

Значимым маркером некроза ткани при морфогистологическом методе исследования стенки графта является изучение динамики ее толщины в разные сроки консервации, так как отек клеток и волокон приведет к увеличению толщины стенки, а затем к последующему тотальному некрозу. К концу 28-х суток консервации выявлены статистически достоверное увеличение стенки артерии относительно показателей 21-х суток, участки разряжения мышечной ткани. Отмечена тенденция увеличения толщины стенки артерии к 42-м суткам. В венозном гомографте выявлено статистически достоверное снижение толщины стенки к концу исследования, что также можно трактовать как отсутствие процесса набухания и отека структур его стенки. Исходя из этих данных можно говорить о более длительной возможности хранения с целью использования венозного трупного кондуита. Оптимальным сроком применения артериальных гомографтов можно считать срок консервации в растворе RPMI 1640 до 21-х суток. Венозные гомографты возможно использовать в срок до 42-х суток.

Литература

1.     Guide to the quality and safety of tissues and cells for human application. URL: https://freepub.edqm.eu/publications/AUTOPUB_17/detail  

2.     О трансплантации органов и (или) тканей человека (с изменениями и дополнениями): Закон РФ от 22 декабря 1992 г. № 4180-I [Электронный ресурс]. URL: http://base.garant.ru/136366/  

3.     Moreira C., Leung A., Farber A. et al. Alternative conduit for infrageniculate bypass in patients with critical limb ischemia // J. Vasc. Surg. 2016. Vol. 64. P. 131-139.e1.

4.     Покровский А.В., Яхонтов Д.И. Значение венозных манжет при бедренно-тибиальном шунтировании // Вестник национального медико-хирургического Центра имени Н.И. Пирогова. 2013. Т. 8, № 4. С. 18-24.

5.     Neville R.F., Tempesta B., Sidway A.N. Tibial bypass for limb salvage using polytetrafluoroethylene and a distal vein patch // J. Vasc. Surg. 2001. Vol. 33, N 2. P. 266-271. DOI: https://doi.org/10.1067/mva.2001.113131

6.     Albers M., Battistella V.M., Romiti M., Rodrigues A.A.E., Pereira C.A.B. Meta-analysis of polytetrafluoroethylene bypass grafts to infrapopliteal arteries // J. Vasc. Surg. 2003. Vol. 37. P. 1263-1269.

7.     Masmejan S., Deslarzes-Dubuis C., Petitprez S., Longchamp A., Haller C., Saucy F. et al. Ten-year experience of using cryo-preserved arterial allografts for distal bypass in critical limb ischaemia // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2019. Vol. 57, N 6. P. 823-831. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejvs.2018.11.020   

8.     Antonopoulos C.N., Papakonstantinou N.A., Hardy D., Lyden S.P. Editor’s choice - cryopreserved allografts for arterial reconstruction after aorto-iliac infection: a systematic review and meta-analysis // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2019. Vol. 58, N 1. P. 120-128. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ejvs.2019.03.003

9.     Калинин Р.Е., Сучков И.А., Карпов В.В., Пшенников А.С., Егоров А.А. Первый опыт применения аллографтов в хирургии магистральных артерий нижних конечностей // Журнал имени Н.В. Склифосовского "Неотложная медицинская помощь". 2020. Т. 9, № 3. С. 442-448. DOI: https://doi.org/10.23934/2223-9022-2020-9-3-442-448  

10. Покровский А.В., Дан В.Н., Чупин А.В. и др. Применение биологических трансплантатов в бедренно-подколенно-берцовой позиции // Ангиология и сосудистая хирургия. 1996. Т. 2, № 3. С. 91-100.

11. Барбараш Л.С., Иванов С.В., Журавлева И.Ю., и др. 12-летний опыт использования биопротезов для замещения инфраингвинальных артерий // Ангиология и сосудистая хирургия. 2006. Т. 12, № 3. С. 91-97.

12. Тищенко И.С., Золкин В.Н., Максимов Н.В. и др. Двухлетние результаты инфраингвинальных реконструкций с использованием аутовенозных шунтов и ксенопротезов // Ангиология и сосудистая хирургия. 2016. Т. 22, № 4. С. 130-135.

13. Калинин Р.Е., Сучков И.А., Егорова А.В., Карпов В.В., Климентова Е.А., Карпов Д.В. Формирование постоянного сосудистого доступа для программного гемодиализа донорской алловеной // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. 2021. Т. 14, № 1. С. 98-103.

14. Калинин Р.Е., Сучков И.А., Карпов В.В., Егоров А.А. Возможности применения аллографтов в хирургическом лечении аневризм подколенных артерий // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2022. Т. 30, № 1. С. 115-122. DOI: https://doi.org/10.17816/PAVLOVJ76343

15. Калинин Р.Е., Сучков И.А., Карпов В.В., Егоров А.А., Пшенников А.С., Карпов Д.В. и др. Возможности трансплантации сосудов в неотложной хирургии магистральных артерий // Новости хирургии. 2021. Т. 29, № 6. С. 747-753. DOI: https://doi.org/10.18484/2305-0047.2021.6.747

16. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия : учебник. 5-е изд., стер. Москва : Литтерра, 2010. 848 с.