Гистологический и молекулярный анализ стенки аневризмы левого желудочка

• Попов М.А.
• Андреева Е.Р.
• Гуревич Л.Е.
• Зыбин Д.И.
• Ратушный А.Ю.
• Матвеева Д.К.
• Абдуллаев С.А.
• Радченкова О.В.
• Буравкова Л.Б.
• Шумаков Д.В.

Резюме

Гибернирующий миокард, потенциально способный к восстановлению своей функции, представляет клинический и научный интерес. В работе выполнен гистологический и молекулярный анализ гибернирующего миокарда в зонах гипо- и нормокинеза у пациента с ишемической болезнью сердца.

Материал и методы. Проведено молекулярное и иммуногистохимическое исследование миокарда левого желудочка у пациента после хирургической реконструкции левого желудочка в сочетании с хирургической реваскуляризацией.

Результаты. При морфологическом исследовании обнаружено нарушение структуры кардиомиоцитов, что коррелирует с накоплением матриксной металлопротеиназы типа 9 в цитоплазме кардиомиоцитов в этих зонах на фоне частичного или полного разрушения их базальных мембран, образованных коллагеном IV типа.

Анализ дифференциальной экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса и молекул, ассоциированных с матриксом, выявил сдвиг транскрипционного профиля, обусловленный снижением экспрессии генов коллагенов, матриксных протеаз, молекул взаимодействия "клетка-матрикс".

Заключение. На основе проведенного анализа можно сделать вывод, что гибернирующий миокард в результате разрушения структуры саркомеров и базальных мембран кардиомиоцитов, снижения активности генов внеклеточного матрикса не способен в дальнейшем обеспечивать сократительную функцию, а жизнеспособные клетки, которые выявляются при морфологическом исследовании, вероятно, функционируют лишь как защитный механизм при раннем формировании рубца.

Ключевые слова:ишемическая болезнь сердца; аневризма левого желудочка; ремоделирование левого желудочка; гибернирующий миокард; гистологический анализ; внеклеточный матрикс; дифференциальная экспрессия генов; полимеразная цепная реакции с обратной транскрипцией

Осложнения ишемической болезни сердца (ИБС) значительно усугубляют течение заболевания и ухудшают прогноз для жизни и трудоспособности. Одной из причин развития хронической сердечной недостаточности (ХСН) у больных с ИБС является снижение насосной функции вследствие формирования аневризмы левого желудочка (ЛЖ) [1, 2].

Самым эффективным методом лечения постинфарктной аневризмы ЛЖ является его хирургическое ремоделирование в сочетании с аортокоронарным шунтированием. Вместе с тем процесс ремоделирования ЛЖ начинает развиваться, вплоть до манифестации клинических проявлений сердечной недостаточности [3]. Несмотря на то что нарушение кинетики миокарда может происходить в результате необратимых рубцовых изменений, многочисленные исследования показали, что большое количество диссинергичных зон продолжает поддерживать метаболическую активность кардиомиоцитов, и, в отличие от фиброзных или рубцовых тканей, такой миокард потенциально может восстанавливать сократительную функцию [4]. В литературе потенциально живой миокард называют гибернирующим. Гибернация миокарда - это стойкое угнетение сократимости жизнеспособного миокарда ЛЖ, возникающее вследствие его гипоперфузии. Гибернирующий миокард как состояние дисфункции сердечной мышцы вследствие хронической гипоперфузии вызывает значительный интерес, что определяет необходимость исследований молекулярных механизмов, лежащих в основе развития этого состояния [5-7].

Целью настоящего исследования были гистологический анализ зоны аневризмы ЛЖ и определение активности целевых групп генов, кодирующих молекулы, вовлеченные в формирование данного повреждения.

Клиническое наблюдение

Больной, 61 год, поступил в кардиохирургическое отделение с жалобами на одышку, загрудинные боли при незначительной физической нагрузке (ходьбе около 150 м, подъеме по лестнице на 2-й этаж), купирующиеся в покое. Пациент с отягощенным сердечно-сосудистым анамнезом. Артериальное давление (АД) регулярно не контролирует (с его слов, максимальное АД до 140/95 мм рт.ст.). Впервые загрудинные боли отметил 5-6 лет назад, тогда же обратился за медицинской помощью. В декабре 2019 г. был госпитализирован в больницу по месту жительства, где проведено комплексное обследование и диагностированы постинфарктный кардиосклероз, аневризма ЛЖ (частично тромбированная). Консультирован кардиохирургом, рекомендовано оперативное лечение.

Данные обследований

Лабораторные показатели: без патологии.

Суточное мониторирование ЭКГ: желудочковая экстрасистолия 4б класса по Lown. Желудочковая тахикардия.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) сердца с контрастированием: МР-картина соответствует картине ЛЖ с наличием крупного тромба в ее полости. Снижение глобальной функции ЛЖ. Фракция выброса (ФВ) 38%.

Электрокардиография (ЭКГ): синусовый ритм с частотой сердечных сокращений (ЧСС) 65 в минуту. Относительное замедление атриовентрикулярного (АВ) проведения. Признаки крупноочагового кардиофиброза миокарда нижней стенки ЛЖ с формированием аневризмы. Выраженные изменения в миокарде ЛЖ.

Эхокардиография (ЭхоКГ): акинез нижнебоковой, нижней стенок ЛЖ на базальном и среднем уровне, аневризма ЛЖ, тромбированная 8,2×10 см. Глобальная сократительная способность миокарда ЛЖ сохранена. ФВ 42%. Гипертрофия миокарда ЛЖ смешанного типа. Диастолическая дисфункция 1-2-го типа.

Коронарография: правый тип коронарного кровоснабжения. Ствол левой коронарной артерии стенозирован на 40%; передняя межжелудочковая ветвь (ПМЖВ) - стеноз 40-50% в проксимальной трети; эксцентричный стеноз до 70%; огибающая артерия (ОА) - эксцентричный стеноз 70-80% в проксимальной трети.

После дообследования больному был выставлен диагноз: "ИБС: безболевая ишемия миокарда. Постинфарктный кардиосклероз (нижней стенки неизвестной давности). Постинфарктная тромбированная аневризма ЛЖ. Желудочковая экстрасистолия 4б класса по Lown. Желудочковая тахикардия".

Кардиоконсилиумом было принято решение о проведении хирургического лечения в объеме геометрической реконструкции ЛЖ по Dor, аортокоронарного шунтирования в условиях искусственного кровообращения.

Результаты

Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964, 2004) и письменным добровольным информированным согласием пациента. Исследование одобрено этическим комитетом Московского областного научно-исследовательского клинического института № 3 от 12.03.2016.

Во время операции были взяты биоптаты из зон гипо- и нормокинеза ЛЖ для проведения гистологического и генетического исследования.

При гистологическом исследовании препараты окрашивали гематоксилином и эозином, а также специальным красителем, предназначенным для выявления мышечных волокон, - фосфовольфрамовым кислым гематоксилином (phosphotungstic acid haematoxylin, PTAH). Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили в автоматическом режиме в гистостейнере Leica Autosteiner XL (Leica Biosystems, Германия) Результаты оценивали с использованием микроскопа Leica DM2000.

ИГХ-методом определяли экспрессию коллагена IV типа и металлопротеиназы-9 (ММП-9) в участках миокарда из зон нормо- и гипокинеза. Для ИГХ-исследования серийные срезы толщиной 2-3 мкм наносили на предметные стекла с адгезивным покрытием. Применяли антитела к коллагену IV типа (Cell Margue, США, моноклональные мышиные антитела, клон CIV22) и ММП-9 (Epitomics, моноклональные кроличьи антитела, клон ЕР 127, США).

Восстановление антигенности для коллагена IV типа проводили по стандартному протоколу в буфере рН 9,0 (Trilogy) по 20 мин при 97°С в модуле PTModule (ThermoScientific, Великобритания), а для ММР-9 в буфере рН 6,0 (Declere) по 20 мин при 95 °С в модуле PT Module (ThermoScientific, Великобритания).

На рис. 1 представлены зона нормокинеза без видимых участков фиброза и зона гипокинеза с выраженным фиброзом.

На рис. 2 представлена экспрессия коллагена IV типа и ММП-9 в участках миокарда из зон нормо-  и гипокинеза.

Сравнительный анализ транскрипционной активности генов в биоптатах из зон гипо- и нормокинеза

Для экстракции РНК биоптаты сердечной мышцы гомогенизировали в RLT-буфере (Qiagen, США) с добавлением 1:100 β-меркаптоэтанола. Для удаления белковой фракции образцы обрабатывали протеиназой К (20 мг/мл, "Евроген", Россия). Очистку РНК проводили с помощью набора RNeasy Mini Kit с использованием спин-колонок (Qiagen, США). Концентрацию очищенной РНК оценивали при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Fisher, Швеция). Для получения комплементарной ДНК (кДНК) проводили обратную транскрипцию с использованием реагентов "Евроген" (Россия). Для температурной инкубации использовали термоциклер 2750 Thermal Cycler, Applied Biosystems (США).

Определение целевых генов

Анализ экспрессии генов проводили с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени с помощью соответствующих праймеров (Qiagen, США), на приборе MX300P (Stratagen, США). С помощью набора RT² Profiler™ Extracellular Matrix & Adhesion Molecules PCR Array (Qiagen, США) определяли экспрессию 84 генов, кодирующих молекулы адгезии и внеклеточного матрикса, согласно инструкции производителя. Для нормализации использовали 5 генов "домашнего хозяйства" (ACTB, B2M, GAPDH, HPRT1, RPLP0), входящих в состав набора. Уровень экспрессии генов в участках гипокинеза относительно областей нормокинеза характеризовали с использованием метода 2-∆∆Ct. Достоверность различий между группами оценивали на основе t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Для того чтобы сформировать панель генов интереса для характеристики зон гипо- и нормокинеза, был использован следующий подход. Были выбраны гены, продукты которых могут быть вовлечены в различные биологические процессы, приводящие к дисфункции сердечной мышцы, определяемой как гибернирующий миокард (табл. 1). При выборе панели генов для предварительного транскриптомного скрининга мы исходили из того, что дисфункция может быть связана с нарушением регуляции внутриклеточных структур, в первую очередь цитоскелета, что определило выбор генов ACTB (основной микрофиламент цитоскелета актин B) и TUBB (белок микротрубочек). Кроме того, может быть изменена межклеточная коммуникация, связанная с активностью продуктов, кодируемых генами GJA1 (белок щелевых контактов коннексин 43) и CDH5 (белок межклеточных контактов кадгерин). Для характеристики метаболических процессов была проанализирована транскрипция генов NOS3 (NO-синтаза), HIF3A (транскрипционный фактор, индуцируемый гипоксией). Для оценки активности ремоделирования сосудистой сети оценивали экспрессию гена VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия) и PLAU (активатор плазминогена, урокиназа); внеклеточного матрикса - COL1A1 (коллагена типа 1 - основного структурного белка матрикса). Все эти гены были детектированы в биоптатах из зон гипо- и нормокинеза (табл. 1). Из всех проанализированных генов только для COL1A1 было выявлено значимое снижение экспрессии в биоптате из области гипокинеза.

Анализ диффренциальной экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса и молекул, ассоциированных с матриксом 

В биоптатах была определена экспрессия 84 генов, ассоциированных с адгезией и реорганизацией внеклеточного матрикса. Выраженной активности генов CNTN1 (Contactin 1), LAMA1 (Laminin, alpha 1), MMP8 (Matrix metallopeptidase 8) не обнаружено ни в одном из образцов. В образце "нормокинез" был выявлен относительно невысокий уровень экспрессии CDH1, COL11A1, MMP1, MMP3, содержание соответствующих матричных РНК (мРНК) в образце "гипокинез" не определялось. CDH1 кодирует Cadherin 1, это кальций-зависимый белок межклеточной адгезии. COL11A1 кодирует одну из двух альфа-цепей коллагена XI типа. MMP1 (матриксная металлопептидаза 1) расщепляет коллагены типов I, II, III, VII и X. MMP3 может расщеплять фибронектин, ламинин, коллагены III, IV, X и IX, а также хрящевые протеогликаны и активирует проколлагеназу.

Дальнейший анализ выявил 13 дифференциально экспрессируемых генов (табл. 2). Выраженные изменения коснулись ряда генов, связанных с протеазной активностью, структурными компонентами матрикса, взаимодействиями "клетка-клетка" и "клетка-матрикс" (рис. 3).

Представлены гены, экспрессия которых изменялась более чем в 2 раза.

Обсуждение

Одним из самых грозных осложнений ИБС является формирование хронической аневризмы ЛЖ, которая, в свою очередь, приводит к развитию хронической сердечной недостаточности (ХСН) в исходе его ремоделирования. По данным разных авторов, 5-летняя выживаемость пациентов с аневризмой левого желудочка (АЛЖ), у которых есть клинические проявления СН, варьирует от 47 до 70%, а 10-летняя выживаемость не превышает 46% [8, 9]. У большинства больных с постинфарктными аневризмами сердца медикаментозная терапия неэффективна, их клиническое состояние прогрессивно ухудшается. Единственным на сегодняшний день радикальным методом лечения данного осложнения является хирургическое лечение с резекцией аневризмы и последующим восстановлением геометрии полости ЛЖ, а также полная реваскуляризация оставшегося жизнеспособного миокарда. Хирургическое лечение позволяет существенно улучшить клиническое течение заболевания, нивелировать симптомы СН, повысить качество жизни и ее продолжительность [10, 11].

При анализе экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса (GO:0005201, Extracellular matrix structural constituent), обнаружено изменение транскрипционного профиля генов, кодирующих структурные белки внеклеточного матрикса в образце "гипокинез". Выявлено снижение экспрессии фибриллярных белков - коллагенов COL8A1, COL16A1, COL7A1, тогда как уровень экспрессии интерстициального гликопротеина тенасцина С (TNC) был увеличен. Известно, что фибриллы коллагеновых белков определяют жесткость тканей, обеспечивая устойчивость к деформации [12], поэтому снижение транскрипции и, возможно, продукции коллагенов в участках гипокинеза может негативно отразиться на состоянии миокарда в этой области.

Действительно, ранее нами было показано, что при изучении структуры внеклеточного матрикса ИГХ-методом в участках миокарда из зон гипокинеза в базальной мембране большинства кардиомиоцитов полностью исчезал каркас, образованный коллагеном IV типа, или он сохранялся лишь частично, при этом БМ была истонченной и прерывистой или сохранялись только ее небольшие фрагменты. В участках гипокинеза было характерно разрушение саркомеров в кардиомиоцитах, увеличение содержания ММП-9 и нарушение целостности или исчезновение базальной мембраны [13].

Увеличение транскрипционной активности гена, кодирующего тенасцин С, можно также интерпретировать как признак нарушения нормального метаболизма миокарда в участках гипокинеза. Известно, что тенасцин С кратковременно экспрессируется в сердце во время эмбрионального развития, но редко выявляется у взрослых, однако его экспрессия существенно повышается при воспалении [14]. Также данный гликопротеин, по-видимому, ухудшает прогнозы по неблагоприятному ремоделированию желудочков, усугубляя воспаление/фиброз [15]. Тенасцин С может быть возможным диагностическим биомаркером и мишенью для молекулярной визуализации воспаления из-за его специфической экспрессии, связанной с воспалением, что может способствовать стратификации пациентов с заболеваниями сердца и выбору соответствующей терапии [16].

В участке гипокинеза при анализе дифференциальной экспрессии генов, ассоциированных с протеазной функцией (GO:0004222, Metalloendopeptidase activity), выявлено снижение экспрессии генов, кодирующих эндопептидазы: металлопротеиназы 16 (MMP16) и 12 (MMP12) а также металлопептидазы с тромбоспондиновым мотивом (ADAMTS13). Транскрипция гена ADAMTS1 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1), напротив, была значимо увеличена. Ранее было показано увеличение ADAMTS1 содержания у старых мышей, в то время как количество субстрата ADAMTS1 версикана снижалось. Блокирование ADAMTS1 с помощью антител подавляло остеонектин-опосредованный синтез коллагена, что, по мнению авторов, может указывать на функцию ADAMTS1 как важного медиатора старения сердца, регулируемого остеонектином [17].

Среди генов, кодирующих молекулы адгезии, снижалась экспрессия субъединиц интегринов ITGA8, ITGA2, ITGAL (GO:0008305, Integrin complex), ассоциированных с взаимодействием "клетка-матрикс". При этом гены катенина дельта 1 (CTNND1) и L-селектина (SELL), связанные с межклеточным взаимодействием, напротив, увеличивали экспрессию. Катенин дельта 1 является одним из ключевых регуляторов межклеточной адгезии, а также контролирует активность ГТФаз семейства Rho и динамику цитоскелета [18]. L-селектин относится к семейству рецепторов адгезии/хоминга и обнаруживается на поверхности лейкоцитов. Повышение активности генов этих рецепторов может свидетельствовать об увеличении содержания лейкоцитов в образце гипокинеза и, возможно, их взаимодействия с кардиомиоцитами.

Заключение

Таким образом, в биоптатах из участков гипокинеза обнаружено снижение активности генов, ассоциированных как с рядом протеазных активностей, так и с формированием коллагенового компонента внеклеточного матрикса. Также отмечено уменьшение содержания мРНК отдельных субъединиц интегриновых комплексов, ассоциированных в первую очередь с взаимодействием "клетка-матрикс". Обнаруженное изменение профиля транскрипции характерно для фибротических и возрастных изменений и подтверждается гистологическим анализом.

Литература

1.     Mosterd A., Hoes A.W. Clinical epidemiology of heart failure // Heart. 2007. Vol. 93, N 9. P. 1137-1146. DOI: https://doi.org/10.1136/hrt.2003.025270  PMID: 17699180; PMCID: PMC1955040.

2.     Sahle B.W., Owen A.J., Chin K.L., Reid C.M. Risk prediction models for incident heart failure: a systematic review of methodology and model performance // J. Card. Fail. 2017. Vol. 23, N 9. P. 680-687. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cardfail.2017.03.005  Epub 2017 Mar 21. PMID: 28336380.

3.     Jha S.R., Ha H.S., Hickman L.D., Hannu M., Davidson P.M., Macdonald P.S. et al. Frailty in advanced heart failure: a systematic review // Heart Fail Rev. 2015. Vol. 20, N 5. P. 553-560. DOI: https://doi.org/10.1007/s10741-015-9493-8  PMID: 25982016.

4.     Ferraris V.A. Commentary: recovering ischemic myocardiumhibernation, autophagy, preconditioning, mitochondria, stem cells, and more // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2021. Vol. 162, N 1. P. e17-e18. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2020.01.002  

5.     Benz D.C., von Dahlen A.P., Huang W., Messerli M., von Felten E., Benetos G. et al. No differences in rest myocardial blood flow in stunned and hibernating myocardium: insights into the pathophysiology of ischemic cardiomyopathy // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2019. Vol. 46, N 11. P. 2322-2328. DOI: https://doi.org/10.1007/s00259-019-04440-2  

6.     Acar E., Aksu A., Akkaya G., Kaya G.Ç. Prevalence and localization of hibernating myocardium among patients with left ventricular dysfunction // Curr. Med. Imaging Rev. 2019. Vol. 15, N 9. P. 884-889. DOI: https://doi.org/10.2174/1573405615666190701110620  

7.     Kloner R.A. Stunned and hibernating myocardium: where are we nearly 4 decades later? // J. Am. Heart Assoc. 2020. Vol. 9, N 3. Article ID e015502. DOI: https://doi.org/10.1161/JAHA.119.015502

8.     Kirklin J.W., Barrat-Boyes B.G. Cardiac Surgery. Vol. 1. Churchill Livingston, 1993. 859 p.

9.     Mitchell G.F., Lamas G.A., Vaughan D.E., Pfeffer M.A. Left ventricular remodeling in the year after first anterior myocardial infarction: a quantitative analysis of contractile segment lengths and ventricular shape // J. Am. Coll. Cardiol. 1992. Vol. 19. P. 1136-1144.

10. Muhlbaier L.H., Pryor D.B., Rankin J.S., Smith L.R. et al. Observational comparison of event-free survival with medical and surgical therapy in patients with coronary artery disease. 20 years of follow-up // Circulation. 1992. Vol. 86, N 5. Suppl. P. II198-II204.

11. Hapira O.M., Davidoff R., Hilkert R.J., Aldea G.S., Fitzgerald C.A., Shemin R.J. Repair of Surgical management of left ventricular aneurysm: long term results of linear repair versus endoaneurysmorhaphy // Ann. Thorac. Surg. 1997. Vol. 63. P. 697-700.

12. Ingber D.E. Tensegrity: the architectural basis of cellular mechanotransduction // Annu. Rev. Physiol. 1997. Vol. 59. P. 575-599. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.59.1.575 PMID: 9074778.

13. Попов М.А., Шумаков Д.В., Гуревич Л.Е., Федоров Д.Н., Зыбин Д.И., Ашевская В.Е. и др. Оценка функциональных свойств гибернирующего миокарда // Клиническая и экспериментальная морфология. 2023. Т. 12, № 1. С. 59-67. DOI: https://doi.org/10.31088/CEM2023.12.1.59-67

14. Imanaka-Yoshida K. Tenascin-C in heart diseases - the role of inflammation // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22, N 11. P. 5828. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22115828  PMID: 34072423; PMCID: PMC8198581.

15. Imanaka-Yoshida K., Tawara I., Yoshida T. Tenascin-C in cardiac disease: a sophisticated controller of inflammation, repair, and fibrosis // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2020. Vol. 319, N 5. P. C781-C796. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpcell.00353.2020  Epub 2020 Aug 26. PMID: 32845719.

16. Abbadi D., Laroumanie F., Bizou M., Pozzo J., Daviaud D., Delage C. et al. Local production of tenascin-C acts as a trigger for monocyte/macrophage recruitment that provokes cardiac dysfunction // Cardiovasc. Res. 2018. Vol. 114, N 1. P. 123-137. DOI: https://doi.org/10.1093/cvr/cvx221  PMID: 29136112.

17. Toba H., de Castro Brás L.E., Baicu C.F., Zile M.R., Lindsey M.L., Bradshaw A.D. Increased ADAMTS1 mediates SPARC-dependent collagen deposition in the aging myocardium // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2016. Vol. 310, N 11. P. E1027-E1035. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpendo.00040.2016  Epub 2016 May 3. PMID: 27143554; PMCID: PMC4935141.

18. Ishiyama N., Lee S.H., Liu S., Li G.Y., Smith M.J., Reichardt L.F. et al. Dynamic and static interactions between p120 catenin and E-cadherin regulate the stability of cell-cell adhesion // Cell. 2010. Vol. 141, N 1. P. 117-128. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.01.017  PMID: 20371349.