Использование блокаторов р38 МАРK в лечении экспериментального перитонита

• Чепурных Е.Е.
• Шурыгина И.А.
• Фадеева Т.В.
• Дремина Н.Н.
• Шурыгин М.Г.

Резюме

Разработка новых методов лечения энтеральной недостаточности, направленных на восстановление целостности кишечника, оптимизацию эффективного иммунного ответа и уменьшение выраженности воспалительных изменений, является важным направлением в хирургии.

Цель - изучить влияние блокатора р38 МАРK (mitogen-activated protein kinases) на течение перитонита в эксперименте.

Материал и методы. Экспериментальное исследование проводили на крысах - самцах линии Wistar в возрасте 6 мес, массой тела 250-300 г. Экспериментальный перитонит воспроизводили по разработанному нами способу. Животные были разделены на контрольную (КГ) и опытную группу (ОГ). В КГ (n=18) через 1 сут после моделирования перитонита внутрибрюшинно вводили 3 мл физиологического раствора, в ОГ (n=18) - 3 мл стерильного водного раствора конъюгата 4-[4-(4-флюорофенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-1H-имидазол-5]-пиридина с поли-1-винил-имидазолом. Выведение из эксперимента проводили на 3, 7 и 14-е сутки, выполняли бактериологическое исследование содержимого брюшной полости и проводили патоморфологическое исследование образцов кишечника. Оценка выраженности энтеральной недостаточности проводилась по разработанной нами шкале.

Результаты. Морфологическое исследование кишечника животных при экспериментальном перитоните показало, что использование блокаторов р38 МАРK в ОГ позволяет достоверно значимо снизить тяжесть повреждения кишечной стенки и выраженность энтеральной недостаточности, начиная с 3-х суток экспериментального исследования по сравнению c КГ. В ОГ наблюдалось снижение уровня инфицированности брюшной полости на 3-и и 7-е сутки экспериментального исследования. Помимо этого, отмечено влияние препарата на проницаемость кишечной стенки для бактерий, в ОГ роста дополнительной микрофлоры не зафиксировано, что свидетельствует об отсутствии бактериальной транслокации при использовании блокатора р38 МАРK.

Заключение. Применение блокатора р38 МАРK в условиях экспериментального перитонита уменьшает выраженность энтеральной недостаточности, не нарушает течения раневого процесса, а также ускоряет процессы восстановления в кишечной стенке, что может иметь важное прикладное значение для клинической практики.

Ключевые слова: перитонит; энтеральная недостаточность; бактериальная транслокация; р38 МАРК

Вторичный перитонит является одним из наиболее частых осложнений острых заболеваний и травм органов брюшной полости, при этом частота развития синдрома энтеральной недостаточности (СЭН) у больных с ургентной патологией достигает 85-100% [1].

В настоящий момент доказано, что СЭН становится мотором в развитии полиорганной недостаточности и абдоминального сепсиса. Кишечник представляет собой сложную систему, которая в нормальных условиях поддерживает тесную интеграцию между своим эпителием, микробиомом и иммунной системой, оказывая влияние на работу всего организма в целом [2]. При гнойных воспалительных процессах в брюшной полости нарушается регуляция всех элементов кишечника, что приводит к нарушению анатомо-физиологической целостности кишечной стенки, усиливаются апоптоз и проницаемость эпителия, а также снижаются его пролиферация, целостность слизистой [3, 4]. Поврежденная слизистая оболочка способствует транслокации бактерий и факторов их вирулентности в брюшную полость и портальный кровоток, дополнительно способствуя активации иммунных механизмов защиты организма от воспаления, что приводит к полиорганной недостаточности [4-6].

Таким образом, СЭН включается в порочный круг метаболического дистресс-синдрома и угнетения интерстициальных механизмов противоинфекционной защиты. Именно поэтому разработка новых методов лечения, направленных на восстановление целостности кишечника, оптимизацию эффективного иммунного ответа и уменьшение выраженности воспалительных изменений [2], является важным направлением в хирургии абдоминального сепсиса.

В настоящий момент существует большое количество лечебных мероприятий, направленных на профилактику и лечение данного синдрома. Хирургические методы включают: устранение источника инфекции, адекватную санацию антисептиками и дренирование брюшной полости, интубацию и декомпрессию тонкой кишки [7]. Консервативные методы заключаются в использовании прокинетиков, метаболических лекарственных средств, стимуляции кишечника, применяются методы экстракорпоральной детоксикации в случае развития полиорганной недостаточности [1]. Но использование этих методов в изолированном виде не может повлиять на исход заболевания, так как каждый из них оказывает влияние только на отдельные звенья патогенеза [8].

Известно, что MAPK (mitogen-activated protein kinases) участвуют в регуляции клеточной активности и оказывают большое влияние не только на координацию клеточных реакций, но и на развитие всех патологических процессов, связанных с воспалением [9]. Среди МАРК самыми изученными являются р38 МАРK - ингибиторы продукции провоспалительных цитокинов [10]. Этот факт позволил потенциально рассматривать их в качестве терапевтической мишени для лечения различных патологий, в том числе воспалительных заболеваний [11]. Управление активностью MAPK может привести к появлению новых возможностей для лечения и профилактики развития гнойных процессов в брюшной полости. В доступной литературе мы не нашли данных об использовании блокаторов р38 МАРK в качестве средства, обладающего активностью в отношении энтеральной недостаточности при гнойных воспалительных процессах в брюшной полости.

Нам удалось определить возможные мишени для угнетения воспалительного процесса, которыми стали белки каскада p38 MAPK, и очертить требования, которым должно отвечать кандидатное лекарственное средство для успешного подавления воспаления при минимизации побочных эффектов. Последнее было чрезвычайно важно вследствие универсальности данного сигнального каскада в тканях человеческого организма.

Учитывая вышесказанное, использование и внедрение новых методов профилактики и лечения синдрома энтеральной недостаточности позволит найти решение данной проблемы.

Цель - изучить влияние блокатора р38 МАРK на течение перитонита в эксперименте.

Материал и методы

Экспериментальное исследование проводили на крысах - самцах линии Wistar в возрасте 6 мес, с массой тела 250-300 г. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в соответствии с нормативом ГОСТа "Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ" (виварий I категории, ветеринарное удостоверение 238 № 000360 от 30.04.2015, служба ветеринарии Иркутской области). Исследования на животных выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 742 от 13.11.1984 "Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных" и № 48 от 23.01.1985 "О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных". Экспериментальное исследование одобрено комитетом по этике Иркутского научного центра хирургии и травматологии (протокол заседания № 1 от 29.02.2019).

Экспериментальный перитонит воспроизводили по разработанному нами способу [12, 13]. Для заражения брюшной полости использовали микст-бактерии - по 0,5 мл взвеси, содержащей 10⁹ микробных тел/мл каждой культуры: клинического изолята Escherichia coli, продуцирующего β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), и 0,5 мл Bacteroides fragilis (штамм ISCST1982, зарегистрирован в Genbank), общий объем микробной взвеси составил 1,0 мл. Используемые штаммы обладали полирезистентностью к антибактериальным препаратам.

Животные были разделены на контрольную (КГ) и опытную группы (ОГ) по 18 животных в каждой. КГ (n=18) животных через 1 сут после моделирования перитонита внутрибрюшинно вводили 3 мл физиологического раствора, ОГ (n=18) - 3 мл стерильного водного раствора конъюгата 4-[4-(4-флюорофенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-1H-имидазол-5]-пиридина с поли-1-винил-имидазолом [14].

Выведение из эксперимента проводили на 3, 7 и 14-е сутки с соблюдением правил гуманного обращения с животными. После эвтаназии выполняли забор содержимого брюшной полости и образцы кишечника.

Бактериологический метод включал аэробную и анаэробную технику культивирования, выделение, количественное определение, идентификацию аэробных и анаэробных микроорганизмов с использованием высокоселективных сред, диагностических экспресс-тестов и полуавтоматического микробиологического анализатора ATB Expression (bioMérieux, Франция) [15].

Кишечник фиксировали в растворе FineFIX (Milestone, Италия), заливали в парафин, выполняли окраску срезов гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование выполняли при увеличении ×40. На срезах оценивали степень энтеральной недостаточности по разработанной нами шкале [16].

Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета программ Statistica 10 for Windows. Данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). Определение значимости различий, полученных данных (р) в сравниваемых выборках проведено по критериям Вилкоксона (W), U-критерию Манна-Уитни. Значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

При оценке морфологических изменений кишечной стенки экспериментальных животных учитывали состояние ворсин, собственной пластинки, наличие язвенных дефектов и протяженность поражения слизистой оболочки (табл. 1). На основании полученных данных определяли выраженность энтеральной недостаточности у животных КГ и ОГ (рис. 1).

Выраженность энтеральной недостаточности в КГ на 3-и сутки составила 14 (12; 15) баллов, на 7-е - 17 (14; 19) баллов, на 14-е сутки - 24 (16; 29) баллов, при этом тяжесть повреждения кишечной стенки по сравнению с 3-ми сутками исследования достоверно значимо нарастала к 7-м и 14-м суткам (p_w=0,046). При этом статистически значимо на 14-е сутки эксперимента изменяется длина ворсин в сторону ее укорочения по сравнению с 3-ми сутками (p_w=0,027).

У экспериментальных животных ОГ выраженность энтеральной недостаточности нарастала в процессе проведения исследования, на 3-и сутки составила 7 (6; 7) баллов, на 7-е сутки - 9,5 (7;12) баллов, на 14-е сутки - 12 (11; 14) баллов, при анализе выявлено достоверно значимое нарастание выраженности энтеральной недостаточности (p_w=0,027) к 14-м суткам по отношению к 3-м суткам исследования. Также наблюдалось достоверное статистически значимое нарастание повреждения эпителиального покрова (p_w=0,04) и собственной пластинки слизистой (p_w=0,027) на 14-е сутки исследования в сравнении с 3-ми сутками.

При проведении сравнительного анализа показателей между КГ и ОГ на 3-и сутки экспериментального исследования установлено, что в КГ статистически значимо выражено укорочение ворсин (p_u=0,037), нарушение эпителиального покрова ворсин (p_u=0,003), наблюдается более значимое повреждение собственной пластинки слизистой (p_u=0,001). Таким образом, выраженность энтеральной недостаточности в КГ была статистически значимо тяжелее по сравнению с ОГ (p_u=0,046).

На 7-е сутки в ОГ наблюдались достоверно значимые отличия по сохранению длины ворсин (p_u=0,009), менее выраженному нарушению эпителиального покрова (p_u=0,003) и стромы ворсин (p_u=0,018), уменьшению протяженности поражения (p_u=0,024), а также выраженности энтеральной недостаточности (p_u=0,004) по сравнению с КГ. К 14-м суткам значимые отличия в ОГ сохранялись по следующим показателям: длине ворсин (p_u=0,002), нарушению эпителиального покрова ворсин (p_u=0,001), строме ворсин (p_u=0,022) и выраженности энтеральной недостаточности (p_u=0,002) в сторону улучшения показателей по сравнению с КГ.

На 14-е сутки эксперимента при морфологическом исследовании в КГ (рис. 2) наблюдается более выраженное повреждение слизистой оболочки слепой кишки - деструкция ворсин, нарушение эпителиального покрова с повреждением собственной пластинки слизистой, в ОГ на 14-е сутки (рис. 3) изменения со стороны слизистой менее выражены.

Использование блокаторов р38 МАРК в ОГ позволяло достоверно значимо снизить тяжесть повреждения кишечной стенки и выраженность энтеральной недостаточности, начиная с 3-х суток экспериментального исследования, по сравнению в КГ.

На 3, 7 и 14-е сутки эксперимента проведено бактериологическое исследование содержимого брюшной полости у экспериментальных животных. Выделенные из экссудата культуры E. coli БЛРС и B. fragilis идентичны штаммам, использованным для моделирования перитонита, при этом продуцирование β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) у E. coli подтверждено.

На 3-и сутки экспериментального исследования у КГ наблюдалось снижение концентрации E. coli БЛРС до 10⁵ КОЕ/мл, а В. fragilis до 10³ КОЕ/мл. К 7-м суткам количество E. coli БЛРС продолжало снижаться до 10³ КОЕ/мл, при этом роста В. fragilis не получено. На 14-е сутки в КГ роста E. coli БЛРС и В. fragilis в экссудате из брюшной полости не выявлено.

В ОГ на 3-и сутки исследования отмечено уменьшение концентрации E. coli БЛРС до 10³ КОЕ/мл, В. fragilis до 10³ КОЕ/мл, на 7-е сутки в ОГ отмечен рост E. coli БЛРС в концентрации 10³КОЕ, роста В. fragilis нет. На 14-е сутки роста патогенной микрофлоры не получено.

В КГ и ОГ, начиная с 7-х суток наблюдения, роста В. fragilis не получено.

Динамика изменения концентрации E. coli БЛРС в экссудате из брюшной полости на 3, 7, 14-е сутки наблюдения представлена в табл. 2.

На 3, 7, 14-е сутки экспериментального исследования в КГ и ОГ установлено снижение концентрации E. coli БЛРС и В. fragilis по сравнению с изначальной (p_w=0,027).

На 7-е сутки эксперимента количество E. coli БЛРС в обеих группах также продолжало снижаться (рис. 4) по сравнению с изначальным (p_w =0,027). У животных КГ концентрация E. coli БЛРС несущественно изменялась по сравнению с 3-ми сутками, но была статистически значимо ниже, чем при первичном инфицировании (p_w=0,027). Достоверное снижение E. coli БЛРС в КГ установлено на 7-е (p_w=0,043) и 14-е сутки (p_w=0,04) по сравнению с 3-ми сутками исследования, а также на 14-е сутки (p_w=0,046) по сравнению с 7-ми сутками. В ОГ статистически значимое снижение E. coli БЛРС отмечено на 14-е сутки относительно 3-х (p_w=0,02) и 7-х суток (p_w=0,027) исследования.

При проведении сравнительного анализа установлены значимые различия в снижении концентрации E. coli БЛРС на 3-и сутки в ОГ по отношению к КГ (p_U=0,023). На 7-е сутки экспериментального исследования достоверных различий в инфицированности экссудата из брюшной полости в КГ по сравнению с ОГ не обнаружено. На 14-е сутки эксперимента у животных ОГ и КГ роста микрофлоры не обнаружено.

На всем протяжении экспериментального исследования в КГ, помимо штаммов E. сoli БЛРС и В. fragilis, используемых для моделирования перитонита, наблюдался рост грамположительной микрофлоры, грибов и лактобактерий на все сроки наблюдения, что свидетельствовало о повышении проницаемости кишечной стенки и развитии бактериальной транслокации у экспериментальных животных. На 3-и сутки в КГ отмечен рост Enterococcus faecalis 10⁴ КОЕ/мл, Peptostreptococcus spp. 10³-10⁴ КОЕ/мл, Lactobacillus sрp. 10⁴ КОЕ/мл, Fusobacterium sрp. 10³ КОЕ/мл, на 7-е сутки получен высев Enterococcus faecalis 10³ КОЕ/мл, Lactobacillus sрp. 10³ КОЕ/мл, на 14-е сутки - Enterococcus faecalis 10⁴ КОЕ/мл.

В ОГ на 3, 7, 14-е сутки роста дополнительной патогенной микрофлоры не получено.

В результате отмечено влияние препарата на проницаемость кишечной стенки для бактерий, так как в КГ, помимо E. coli БЛРС и В. fragilis, использованных для воспроизведения экспериментального перитонита, наблюдался рост грамположительной микрофлоры, грибов и лактобактерий на все сроки наблюдения. В ОГ рост дополнительной микрофлоры не зафиксирован, что свидетельствует об отсутствии бактериальной транслокации при использовании блокатора р38 МАРК. Таким образом, повреждение кишечной стенки у экспериментальных животных ОГ менее выражено.

Обсуждение

Развитие энтеральной недостаточности при распространенном гнойном перитоните представляет сложный процесс патофизиологических изменений. За счет снижения или отсутствия моторики желудочно-кишечного (ЖКТ) тракта наблюдается повышение внутрикишечного давления с последующим нарушением барьерной функции слизистой оболочки кишки. Одновременно с этим происходит активная бесконтрольная транслокация микроорганизмов из просвета ЖКТ в брюшную полость и портальный кровоток, что приводит к выбросу провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и развитию системного воспалительного ответа [5, 15]. Энтеральная недостаточность прогрессирует и приводит к развитию полиорганной недостаточности и абдоминального сепсиса.

В исследовании показано, что воспроизведенный в эксперименте распространенный перитонит приводит к развитию повреждения кишечной стенки с развитием бактериальной транслокации на всех сроках наблюдения. Отмечено достоверно значимое нарастание в динамике выраженности энтеральной недостаточности, что подтверждало наличие кишечной дисфункции. На фоне повреждения кишечной стенки повышается ее проницаемость. Нами подтверждено наличие бактериальной транслокации в КГ: так, помимо E. coli БЛРС и В. fragilis, получен рост Enterococcus faecalis, Peptostreptococcus spp., Lactobacillus sрp., Fusobacterium sрp. в течение всего эксперимента.

В свою очередь, однократное использование блокатора р38 МАРК в ОГ позволило статистически значимо уменьшить тяжесть повреждения кишечной стенки и выраженность энтеральной недостаточности у экспериментальных животных на протяжении всего исследования. Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии препарата, содержащего блокатор р38 МАРК, на микрофлору брюшной полости при экспериментальном перитоните. Использование данного препарата позволяет снизить уровень инфицированности брюшной полости в ОГ за счет уменьшения концентрации E. coli БЛРС и В. fragilis на 3-и и 7-е сутки экспериментального исследования. На 3-и сутки в ОГ установлены значимые различия в снижении концентрации E. coli БЛРС по отношению к КГ (p_U=0,023).

Помимо этого, наблюдалось усиление барьерной функции слизистой оболочки кишечника, что позволило предотвратить транслокацию бактерий и снизить уровень микробной контаминации брюшной полости по сравнению с группой контроля. Отсутствие бактериальной транслокации дополнительно свидетельствует о менее выраженном повреждении кишечной стенки у экспериментальных животных. Следовательно, блокатор р38 МАРК (стерильный водный раствор конъюгата 4-[4-(4-флюорофенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-1H-имидазол-5]-
пиридина с поли-1-винил-имидазолом) обладает противовоспалительным действием за счет снижения выработки провоспалительных факторов, что влияет на течение гнойно-воспалительного процесса в брюшной полости при экспериментальном перитоните.

Заключение

Применение блокатора р38 МАРК в условиях экспериментального перитонита уменьшает выраженность энтеральной недостаточности, не нарушает течения раневого процесса, а также ускоряет процессы восстановления в кишечной стенке. Таким образом, использование блокатора р38 МАРК в лечении гнойно-воспалительных процессов брюшной полости может иметь важное прикладное значение в клинической практике.

Литература

1.     Алиев С.А., Алиев Э.С. Синдром энтеральной недостаточности: современные положения о терминологии, патогенезе и лечении (обзор литературы) // Вестник хирургии имени И.И. Грекова. 2020. Т. 179, № 6. С. 101-106. DOI: https://doi.org/10.24884/0042-4625-2020-179-6-101-106

2.     Meng M., Klingensmith N.J., Coopersmith C.M. New insights into the gut as the driver of critical illness and organ failure // Curr. Opin. Crit. Care. 2017. Vol. 23, N 2. P. 143-148. DOI: https://doi.org/10.1097/MCC.0000000000000386

3.     Zhang S., Zheng S., Wang X., Shi Q., Wang X., Yuan S. et al. Carbon monoxide-releasing molecule-2 reduces intestinal epithelial tight-junction damage and mortality in septic rats // PLoS One. 2015. Vol. 10. Article ID e0145988. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145988

4.     Mittal R., Coopersmith C.M. Redefining the gut as the motor of critical illness // Trends Mol. Med. 2014. Vol. 20, N 4. P.  214-223. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molmed.2013.08.004  

5.     Дремина Н.Н., Чепурных Е.Е., Фадеева Т.В., Шурыгина И.А. Бактериальная транслокация при перитоните // Современные проблемы науки и образования. 2018. № 6. С. 48. DOI:  https://doi.org/10.17513/spno.28251

6.     Сараев А.Р., Назаров Ш.К. Патогенез и классификация распространенного перитонита // Хирургия. Журнал имени Н.И. Пирогова. 2019. № 12. С. 106-110. DOI: https://doi.org/10.17116/hirurgia2019121106

7.     Косинец В.А. Синдром энтеральной недостаточности: патогенез, современные принципы диагностики и лечения // Новости хирургии. 2008. Т. 16, № 2. С. 130-138.

8.     Косинец В.А. Патогенетические аспекты комплексного лечения пациентов с распространенным гнойным перитонитом // Вестник ВГМУ. 2014. Т. 13, № 4. С. 63-69.

9.     Castelo-Soccio L., Kim H., Gadina M. et al. Protein kinases: drug targets for immunological disorders // Nat. Rev. Immunol. 2023. Vol. 23. P. 787-806. DOI: https://doi.org/10.1038/s41577-023-00877-7

10. Kumar S., Boehm J., Lee J.С. p38 MAP kinases: key signalling molecules as therapeutic targets for inflammatory diseases // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2. P. 717-726. DOI:  https://doi.org/10.1038/nrd1177

11. Sanz-Ezquerro J.J., Cuenda A. p38 signalling pathway // Int. J. Mol. Sci. 2021. Vol. 22, N 3. P. 1003. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22031003

12. Чепурных Е.Е., Шурыгина И.А., Фадеева Т.В., Григорьев Е.Г. Способ моделирования перитонита: патент 2716482 Рос. Федерация; МПК G09 В23/28, А61 В17/00/; патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Иркутский научный центр хирургии и травматологии". № 2019109595; заявл. 01.04.2019; опубл. 11.03.2020. Бюл. № 8.

13. Чепурных Е.Е., Шурыгина И.А., Фадеева Т.В., Григорьев Е.Г. Экспериментальное моделирование разлитого гнойного перитонита // Acta Biomedica Scientifica. 2019. Т. 4, № 3. С.  117-121. DOI: https://doi.org/10.29413/ABS.2019-4.3.15

14. Способ лечения энтеральной недостаточности при воспалительных и травматических повреждениях брюшины: патент 2749435 Рос. Федерация; МПК А61К 31/5025, А61К 31/4174; патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Иркутский научный центр хирургии и травматологии". № 2020139334; заявл. 27.11.2020; опубл. 10.06.2021. Бюл. № 16.

15. Фадеева Т.В., Шурыгина И.А., Дремина Н.Н., Ветохина А.В., Чепурных Е.Е., Шурыгин М.Г. Бактериальная транслокация при экспериментальном перитоните // Забайкальский медицинский вестник. 2019. № 4. С. 128-133.

16. Шурыгина И.А., Чепурных Е.Е., Дремина Н.Н., Шурыгин М.Г. Разработка шкалы оценки выраженности энтеральной недостаточности // Современные проблемы науки и образования. 2021. № 5. С. 95. DOI: https://doi.org/10.17513/spno.31151